一次性使用衛生用品口罩中綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌的分析

趙陽，游元丁，李躍紅，陳露，林雪丹，冉茂乾，焦彥朝

（1.六盤水市口岸服務中心，貴州六盤水 553000;2.國家果蔬檢測重點實驗室，貴州六盤水553000;3.貴陽海關綜合技術中心，貴州貴陽 550081）

CNAS-RL02:2018《能力驗證規則》中說明能力驗證是實驗室重要的外部質量控制活動，參與能力驗證活動是除現場評審以外，可以證明實驗室在相關檢測領域具有檢測能力的一種方式[1-2]。參與能力驗證活動可通過對人員能力、檢測方法、設施場所和儀器設備等方面判斷實驗室是否具有滿足相關檢測活動的需求[3]。中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）將能力驗證結果的滿意度評價作為實驗室能力判斷的一項重要依據[4-5]。因此，參與能力驗證活動對檢測實驗室具有重要意義。

新型冠狀病毒主要經呼吸道飛沫和密切接觸傳播[6]，國家衛生健康委員會印發的《預防新型冠狀病毒感染的肺炎口罩使用指南》[7]指出，口罩可以降低被新型冠狀病毒感染的風險?？谡植粌H可以防止已被感染新型冠狀病毒的病人噴射飛沫，同時降低飛沫量和噴射速度，還可以阻擋外部含病毒的飛沫核，防止他人吸入。目前，口罩成為大眾預防新型冠狀病毒的首要防疫用品，因此，相關檢測實驗室對口罩質量的把關極為重要。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，又稱銅綠假單胞菌）是兩種常見的“化膿性致病菌”。金黃色葡萄球菌在臨床上主要引起皮膚及軟組織化膿性感染、上呼吸道感染等[8]；在燒傷、外科創傷手術后使用受綠膿桿菌污染的衛生用品可引起局部化膿感染[9]。口罩直接接觸人體的皮膚或粘膜，關系到使用者的身體健康安全，醫用防護口罩技術要求規定微生物指標綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌不得檢出[10]。為此，本實驗室參照一次性使用衛生用品衛生標準[11]及一次性使用衛生用品中致病菌的檢測參試指導書參與了由國家市場監督管理總局組織的2020年國家級能力驗證活動，確保檢測人員具有檢測一次性使用衛生用品中致病菌的技術能力，同時提高防疫防護用品的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

樣品為真空西林瓶包裝的含菌口罩，購自北京海關；綠膿桿菌檢測樣品編號為20DP-2803、20DP-0126；金黃色葡萄球菌檢測樣品編號為20DP-1248、20DP-1709。

1.2 培養基及試劑

SCDLP 培養液、十六烷三甲基溴化銨瓊脂、血瓊脂平板、營養瓊脂（NA）、Baird-Parker 平板、綠膿菌素測定培養基、硝酸鹽胨水培養基、甘露醇培養液、凍干血漿、明膠等培養基及生化試劑管均購自北京陸橋，已進行相關驗收且在有效期內；VITEK2 革蘭氏陽性（GP）細菌鑒定卡，購自生物梅里埃公司且在有效期內。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備待測樣液

根據參試指導書要求，在生物安全柜內無菌操作打開西林瓶，瓶內樣品為口罩實物樣品，可直接用于檢測，無需再次稱量。使用滅菌剪刀將口罩剪碎后加入100 mL 滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到生理鹽水樣，即為待測樣液。

1.3.2 綠膿桿菌檢測方法

取樣液5 mL，加入50 mL SCDLP 培養液中，充分混勻，于（35±2）℃培養18～24 h，從培養液的薄菌膜處挑取培養物，劃線接種CN 平板、十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板，置（35±2）℃培養18～24 h，觀察菌落特征。挑取可疑菌落劃線接種營養瓊脂進行純培養，于（36±1）℃培養18～24 h，采用全自動微生物鑒定儀（VITEK 2 COMPACT）進行鑒定。同時挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢結果為革蘭氏陰性菌者，進行生化試驗。

1.3.3 金黃色葡萄球菌檢測方法。

取樣液5 mL，加入50 mL SCDLP 培養液中，充分混勻，于（35±2）℃培養18～24 h，取增菌液劃線接種血瓊脂平板及Baird-Parker 平板。挑取可疑菌落劃線接種營養瓊脂進行純培養，于（36±1）℃培養18～24 h，采用全自動微生物鑒定儀（VITEK 2 COMPACT）進行鑒定。同時挑取典型菌落進行革蘭氏染色，鏡檢結果為革蘭氏陽性球菌者，進行生化試驗。

2 結果與分析

2.1 綠膿桿菌檢測結果

2.1.1 培養液特征及平板上菌落形態

如表1 所示，將樣液加入到SCDLP 培養液中，36 ℃培養24 h 后可觀察到培養液呈黃綠色，有一層薄菌膜。從薄菌膜處挑取培養物，劃線接種于十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板、CN 平板。樣品編號20DP-0126 和20DP-2803 挑取的培養物在十六烷三甲基溴化銨平板上生長良好，菌落扁平，邊緣不整；在CN平板上為圓形、平滑、濕潤的黃綠色菌落，紫外光照射下觀察有熒光，菌落形態均為典型綠膿桿菌菌落特征。

2.1.2 生化鑒定

挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，20DP-0126 和20DP-2803 樣品鏡檢結果均為革蘭氏陰性桿菌，并進行相應的生化試驗。表2 結果顯示，氧化酶試驗陽性、綠膿桿菌毒素試驗陽性、硝酸鹽還原產氣陽性、明膠液化陽性、42 ℃生長試驗陽性，符合典型綠膿桿菌生化特征。20DP-0126 和20DP-2803 口罩樣品檢測結果均為綠膿桿菌檢出。

表1 綠膿桿菌口罩樣品菌落形態表

表2 綠膿桿菌口罩樣品生化鑒定結果表

2.2 金黃色葡萄球菌檢測結果

2.2.1 培養液特征及平板上菌落形態

SCDLP 培養液經36 ℃培養24 h 后培養基變渾濁，挑取培養物劃線接種血平板、Baird-Parker 平板。如表3 所示，樣品編號20DP-1248、20DP-1709 在血瓊脂培養基上菌落特征為金黃色、大而突起、圓形、不透明、表面光滑、周圍有溶血圈；在Baird-Parker 平板上菌落特征為黑色、表面光滑、凸起、濕潤有光澤、淺色邊緣外有一清晰帶。菌落形態在血瓊脂平板與Baird-Parker 平板上均為典型金黃色葡萄球菌菌落特征。

表3 金黃色葡萄球菌口罩樣品菌落形態表

2.2.2 生化鑒定

挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，20DP-1248 和20DP-1709 樣品鏡檢結果均為革蘭氏陽性葡萄球菌，并進行相應的生化試驗。表4 結果顯示，甘露醇發酵試驗陽性、血漿凝固酶試驗陽性，20DP-1248 和20DP-1709 口罩樣品檢測結果均為金黃色葡萄球菌檢出。

表4 金黃色葡萄球菌口罩樣品生化鑒定結果表

2.3 全自動微生物生化系統鑒定

分別從每個樣品不同平板上挑取3 個可疑菌落劃線接種營養瓊脂，使用純培養物進行全自動微生物生化系統VITEK2 鑒定。20DP-0126、20DP-2803可疑菌落純培養后均鑒定為99%概率為綠膿桿菌；20DP-1248、20DP-1709 可疑菌落純培養后均鑒定為99%概率為金黃色葡萄球菌。VITEK2 鑒定結果均與傳統生化反應鑒定結果相符合。

3 結論

參考文獻：

[1] 中國合格評定國家認可委員會.CNAS-RL02:2018 能力驗證規則按照一次性使用衛生用品衛生標準及能力驗證參試指導書進行檢測，結果表明，20DP-0126、20DP-2803 檢出綠膿桿菌，20DP-1248、20DP-1709檢出金黃色葡萄球菌。[S].2018.

[2] 趙陽,游元丁,冉茂乾,等.一例志賀氏菌測量審核分析[J].安徽農業科學,2020,48(8):201-203.

[3] 任敏紅,依力哈木·爾西丁,王興華,等.能力驗證在檢測實驗室質量管理中的應用[J].中國檢驗檢測,2019,27(2):58-60,23.

[4] 劉穎,薛靚.測量審核的實施方法及滿意度評定[J].中國測試,2012,38(S1):107-110.

[5] 區偉珍. 淺談實驗室質量控制的方法[J]. 廣東化工,2015,42(7):116,83.

[6] 國家衛生健康委員會辦公廳,國家中醫藥管理局辦公室.關于印發新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)的通知 國衛辦醫函〔2020〕184 號[EB/OL].(2020-03-03)[2021-04-12]http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2020-03/04/content_5486705.htm.

[7] 國家衛生健康委員會.關于印發新型冠狀病毒感染不同風險人群防護指南和預防新型冠狀病毒感染的肺炎口罩使用指南的 通 知[EB/OL].(2020-01-30)[2020-04-12]http://www.gov.cn/xinwen/2020-01/31/content_5473401.htm.

[8] 范陳良,李小四,吳曉燕.皮膚及軟組織感染中金黃色葡萄球菌臨床分布和耐藥特性分析[J].中國抗生素雜志,2017,42(5):413-417.

[9] 韓青松,簡永利,涂宜強,等.綠膿桿菌研究進展[J].畜牧與飼料科學,2012,33(1):122-124.

[10] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB 19083-2003 醫用防護口罩技術要求[S].北京:中國標準出版社,2003.

[11] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.中國國家標準化管理委員會.GB 15979-2002 一次性使用衛生用品衛生標準[S].2002.