福建七葉一枝花組織培養及主效成分測定

羅曉鋒，周建金，葉煒，喬鋒，廖承樹

(三明市農業科學研究院，福建 沙縣 365500)

2015年版《中國藥典》規定，中藥重樓為百合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖[1]。七葉一枝花的主要有效成分是甾體皂苷，其皂苷元主要為異螺甾烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元[2]。現代藥理研究表明，七葉一枝花具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒、避孕等作用，其良好的療效被眾多的制藥工業應用，是云南白藥、宮血寧、熱毒清等重要中成藥的主要成分，用途極為廣泛[3-5]。

由于近年重樓藥材供需矛盾突出，七葉一枝花已被列為國家重點保護野生藥材瀕危物種[6-7]。因此，積極開展七葉一枝花組織培養是解決當前重樓藥材嚴重短缺和更好地保護其野生植物資源的有效方法。然而到目前為止，關于七葉一枝花植物的組織培養還未取得實質性進展[8-12]。本研究以福建七葉一枝花的小苗、根、帶柄葉為外植體，開展組織培養工作，以期利用組織培養技術有效解決福建七葉一枝花種苗繁育的瓶頸問題，為生產七葉一枝花植物次生代謝產物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

七葉一枝花采自福建省三明市沙縣大佑山，海拔900 m，在2—3月，取1 a生的整株植株帶土挖取，置于自封袋內帶回實驗室。重樓皂苷含量檢測采取七葉一枝花組培苗組培過程中，產生的愈傷組織、根系和塊莖。

重樓皂苷Ⅰ對照品(111590-201604)、重樓皂苷Ⅱ對照品(111591-201604)、重樓皂苷Ⅵ對照品(111592-201604)、重樓皂苷Ⅶ對照品(111593-201604)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純；水為雙蒸水。其他試劑均為分析純。Waters 2695高效液相色譜儀；WND200型粉碎機；EX1252H電子天平。

1.2 方法

1.2.1 七葉一枝花外植體消毒和誘導

選取七葉一枝花的整株小苗、根、帶柄葉為外植體。在超凈工作臺上先將各外植體經70%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞溶液消毒6～8 min，無菌水沖洗待用；將消毒完成的外植體接種于1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1培養基。不同類型的外植體各接種60個，20個為1個重復，重復3次。每個誘導培養80 d，有長出愈傷組織、隱芽的外植體，屬誘導成功，并換算誘導率。外植體誘導率=100%×產生愈傷、隱芽的外植體數/接入外植體總數。

1.2.2 七葉一枝花增殖分化與生根培養

將長出的愈傷組織、側芽接入分化培養基1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA1.0 mg·L-1中培養。分化出小苗，既切下轉接生根培養基1/2MS+NAA 0.3 mg·L-1中培養。未分化的繼續增殖分化培養。待有足夠的增殖數量后，進行統計分析。轉接時1瓶接4塊，稱重，轉接60 d后，統計增殖率、絕對生長速率和相對生長速率。以上處理5瓶為1個重復，重復3次。

以上培養條件為溫度(20±2)℃，光照時間12 h·d-1，光照度1 000～1 500 lx。

1.2.3 重樓皂苷含量測定

參照2015版《中國藥典》測重樓皂苷的方法[1]，對七葉一枝花組培的塊莖芽、根系、生根苗，進行重樓皂苷含量的測定。色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫；檢測波長為203 nm。進樣量10 μL；檢測波長205 nm；柱溫25 ℃；流速為0.8 mL·min-1。

表1 梯度洗脫程序

對照品溶液的制備。分別精密稱取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL中含重樓皂苷1、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ分別為0.366 7、0.338 3、0.345 6、0.326 7 mg的混合溶液，搖勻，作為混合對照品溶液。

供試品溶液的制備。取組織培養過程中的根、塊莖、愈傷組織適量，粉碎成末(過3號篩)，每份精密稱定0.5 g，重復3次。置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，冷卻后再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液即得。

1.2.4 線性關系考察

分別精密吸取上述混合對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mL，置1.5 mL的進樣量瓶中，加甲醇至1 mL，即得每1 mL中含重樓皂苷Ⅰ分別為0.036 67～0.183 3 mg，重樓皂苷Ⅱ分別為0.033 83～0.169 2 mg，重樓皂苷Ⅵ分別為0.034 56～0.172 8 mg，重樓皂苷Ⅶ分別為0.032 67～0.163 4 mg的系列標準溶液，按2.1節色譜條件進樣，記錄峰面積，以質量濃度(x，mg·mL-1)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，進行線性回歸。

1.2.5 樣品測定

按上述色譜條件進樣測定，記錄液相色譜圖，并計算平均含量。

2 結果與分析

2.1 不同類型外植體的誘導情況

外植體在消毒接種3 d后部分出現污染。消毒成功的小苗15 d后在塊莖部位出現不同程度的膨大，30 d后葉片枯萎，現出隱芽和愈傷組織。根系和帶柄葉接種后，60 d后在斷口處長出愈傷組織(圖1)。

a—小苗消毒接入誘導培養基；b—小苗葉片枯萎，塊莖膨大，現出側芽；c—根部斷口膨大長出愈傷組織；d—葉柄斷口膨大長出愈傷組織。

從表2可以看出，采用乙醇加升汞的方法能有效殺死外植體的菌類。根部染菌率最低，為10%；帶柄葉染菌率最高，為50%，因此，可適當增加消毒時間降低帶柄葉的污染。不同外植體類型，通過誘導培養基：1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1，能成功誘導出愈傷或隱芽，但不同外植體類型誘導率差異明顯。以小苗誘導率顯著最高，為58.33%，根和帶柄葉誘導率差異不明顯。因此，福建七葉一枝花組織培養的外植體建議采用小苗。

表2 不同類型外植體對七葉一枝花組培誘導的影響

2.2 增殖與生根

由圖2可知，將誘導出的愈傷組織、側芽轉接分化培養基1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1培養，能完成正常的增殖和分化過程；將分化的小苗轉接于生根培養基1/2MS+NAA0.3 mg·L-1中，則小苗塊莖變粗壯，并產生大量根系。

a—叢生芽增殖；b—叢生芽分化成小苗；c—愈傷組織增殖與分化成芽；d—分化苗生根。

從表3中可以看出，不同增殖途徑對組培影響很大。叢生芽途徑的絕對生長速率、相對生長速率、增殖率均顯著低于愈傷組織途徑。不同增殖途徑不影響小苗的生根，因此，福建七葉一枝花組織培養建議采用愈傷組織途徑。

表3 不同組培途徑對增殖的影響

2.3 標準曲線結果

按2.1節色譜條件進樣，得到如圖3的重樓混合對照液的HPLC色譜圖。記錄峰面積，以質量濃度(x，mg·mL-1)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，進行線性回歸，得到如圖4的標準曲線。從圖4中可以看出，皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的R2值分別為0.998 9、0.997 2、0.997、0.997 8，表明線性條件良好，可作測量樣品的標準曲線來使用。

1—重樓皂苷Ⅶ；2—重樓皂苷VI；3—重樓皂苷Ⅱ；4—重樓皂苷Ⅰ。

圖4 標準曲線

2.4 不同組培產物的皂苷含量分析

七葉一枝花的主效成分為甾體皂苷。從表4和圖5可以得出，組培過程中，福建七葉一枝花產生的根、塊莖、愈傷組織均含有重樓皂苷成分，根部的總皂苷含量達0.342%，愈傷組織達0.339%，塊莖的總皂苷含量最高，達0.497%(2015版藥典要求0.6%)。3個部位的4種皂苷成分中，以偏諾皂苷—皂苷Ⅶ占絕對優勢，其余3種皂苷含量極低或未檢出。

表4 組培中不同部位的皂苷含量

圖5 福建七葉一枝花組培過程中不同部位的HPLC色譜圖

3 討論

3.1 七葉一枝花組織培養

組培快速繁殖技術是解決七葉一枝花種苗問題的重要途徑。本文在對七葉一枝花組培的過程中發現，在適宜時期選擇有效外植體部位非常重要。本研究中所采用的小苗、根、帶柄葉為外植體，均能成功誘導出愈傷或隱芽，但不同外植體類型誘導率差異明顯。以小苗誘導率顯著最高，為58.33%，而且產生的愈傷組織和叢生芽數量也更多，生長質量也更好，因而也確保了后繼的成功增殖。本研究也曾采用了除第一節根莖以外的其他根莖作為外植體進行愈傷組織誘導，但最終都未獲得愈傷組織，這與胡天印等[11-12]的研究結果相似。因此，七葉一枝花頂芽保持有較強的潛在分裂能力，細胞經誘導培養后較易脫分化產生愈傷組織或叢生芽，而本文采用沒有傷口的整株小苗，既能減少頂芽在消毒時受到傷害，又能為頂芽塊莖生長提供營養，只是如何加快愈傷組織或叢生芽的誘導速率、正確引導愈傷組織或叢生芽快速增殖，是建立福建七葉一枝花組織培養體系的關鍵。

3.2 七葉一枝花組培生產次生代謝產物

李恒[8]在重樓屬植物的書中提到，重樓愈傷組織生長緩慢，檢測出不含重樓皂苷。本研究重樓皂苷作為七葉一枝花植物中的最主要的有效成分，屬于植物的次生代謝產物。經多次繼代培養的福建七葉一枝花叢生芽和愈傷組織，是可以在產生大量初生代謝產物的基礎上，進一步產生重樓皂苷次生代謝物。因此，通過組織培養生產重樓次生代謝產物是一種可行的、具有應用潛力的生物技術途徑。在七葉一枝花植物以后的組織培養研究過程中，是否可通過改變培養基中各成分的種類、比例，提高愈傷組織的增殖率和皂苷含量還有待進一步研究。

本研究以福建七葉一枝花的小苗、根、帶柄葉為外植體，開展組織培養和皂苷含量測定研究，初步建立了福建七葉一枝花組織培養體系，證實了通過組織培養獲得重樓皂苷次生代謝物的可行性，為繁殖福建七葉一枝花種苗提供新途徑，同時也為生產七葉一枝花植物次生代謝產物奠定了工作基礎。