大豆北方莖潰瘍病菌熒光RAA檢測方法的建立

陳吳健，范宇博，嚴穎鵬，林曉佳，任琰，吳志毅，程帆，郭利川，應清界

(1.杭州海關技術中心，浙江 杭州 310016；2.江蘇奇天基因生物科技有限公司，江蘇 無錫 214000)

大豆莖潰瘍病是由大豆莖潰瘍病菌感染大豆所引起的疾病，大豆莖潰瘍病分大豆北方莖潰瘍病和大豆南方莖潰瘍病，其病原體分別為大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthephaseolorumvar.caulivora，DPC)和大豆南方莖潰瘍病菌(Diaporthephaseolorumvar.meridionalis，DPM)，DPC屬子囊菌門、球殼目、間座殼科、間座殼屬。該病菌侵染植株后迅速發展形成莖桿環狀損傷，并可導致正在生長的植株死亡。發病嚴重的田塊有80%的植株受到侵染，造成嚴重的經濟損失。在美國、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭、意大利、前南斯拉夫、克羅地亞等歐洲部分國家及地區有發生報道，是國外大豆生產上的重要病害[1]。

2005年，我國首次從美國進境大豆發現有大豆北方莖潰瘍病菌[2]，進境大豆攜帶大量的豆桿、豆莢及其他雜質，帶菌的可能性很大。在進境大豆的運輸、加工、下腳料的處理過程中都有傳播擴散的可能，一旦傳入將對我國大豆生產造成嚴重影響。由于傳入風險高，我國絕大部分地區都適合該病菌生長[3]，因此，被我國列為檢疫性有害生物，由此亟需一種快速簡便的方法應對口岸進出糧谷的檢測。

重組酶介導擴增(recombinase aid amplification，RAA)是一種新的在恒溫下可以快速擴增核酸的技術，RAA擴增法采用來自于大腸桿菌的recA重組酶，利用其在常溫下可以與DNA緊密結合的特性，并結合引物形成聚合體掃描雙鏈DNA，在與引物同源的序列處使雙鏈DNA解旋。在單鏈結合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，新的DNA片段可以在體外快速地擴增出來。這個體外DNA擴增的過程不需要高溫，一般在37 ℃或者室溫下反應15～30 min即可得到與傳統高溫PCR相同的目的片段[4]。

本研究建立了大豆北方莖潰瘍病的熒光RAA檢測方法，并對方法的特異性、靈敏度及對實際樣品的檢測進行了系統研究。為我國進口大豆的DPC檢測提供了一種靈敏、精準、簡便的新方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

取大豆常見病害及其近似菌株進行試驗，驗證引物的特異性。供試菌株均為本實驗室分離鑒定(表1)。

表1 供試菌株基本情況

1.2 標準樣品的制備

通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得大豆北方莖潰瘍病菌基因組序列，選擇大豆北方莖潰瘍病菌的特異性保守基因作為目標檢測基因，并進行多序列比對，從中選出一段保守序列，根據序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成DNA質粒，質粒大小298 bp；為了方便進行靈敏度測定，將由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的大豆北方莖潰瘍病菌DNA質粒轉化至大腸桿菌中，37 ℃培養8 h，采用商品化的質粒提取試劑盒進行大豆莖潰瘍病菌DNA質粒提取，經濃度測定后將其濃度稀釋至1010μL-1備用。

1.3 特異性引物、探針的設計

根據RAA技術引物和探針設計原則，通過篩選和評價，設計的熒光探針修飾在探針中間，熒光報告基團修飾在離5′端堿基數32 bp的位置上，淬滅基團修飾在離3′端堿基數15 bp的位置上，熒光報告基團與淬滅基團之間間隔2個堿基位置，其中1個堿基用于修飾四氫呋喃殘基。

1.4 主要設備和試劑

RAA基礎熒光通用反應試劑(含重組酶等凍干粉)；反應緩沖液(450 mmol Tris-HCl Buffer，260 mmol MgAc，10%m/VPEG 10 000)由江蘇奇天基因科技有限公司提供；探針與引物混合物(探針0.02 mmol，引物0.05 mmol)；核酸提取試劑盒為QIAGEN DNeasy Plant Mini kit；RAA-F1620熒光檢測儀(奇天基因)。

1.5 DNA的提取

供試菌株在PDA上培養后，刮取菌絲，液氮研磨后取0.1～0.2 g。大豆用萊馳MM400球磨儀充分粉碎，取0.1～0.2 g，用核酸試劑盒提取DNA。

1.6 特異性驗證

取8個反應管，吸取27 μL反應緩沖液，加入2 μL探針與引物的混合物，充分混勻；將混勻后的緩沖液加入到RAA基礎熒光通用反應試劑管中，使凍干粉充分溶解并混勻；在8個配制好的管中分別依次加入1 μL陰性質控品、大豆北方莖潰瘍病菌樣本、大豆南方莖潰瘍病菌樣本、大豆擬莖點種腐病菌、大豆鐮刀菌、大豆莖莢枯腐病菌、大豆紫斑病菌、大豆炭疽病菌DNA各1 μL為模板，每個反應管進行充分混勻，每個反應管總體積為50 μL；將混勻的反應管放入RAA-F1620熒光檢測儀中，在39 ℃反應20 min。

1.7 靈敏度檢測

將5 μL 1010mL-1大豆莖潰瘍病菌DNA質粒制成10倍梯度的工作標準品1～6，濃度分別為：1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102mL-1；吸取376 μL反應緩沖液，加入16 μL探針與引物的混合物，充分混勻；吸取混勻后的緩沖液49 μL試劑分別加入到7個RAA基礎熒光通用反應試劑管中，使凍干粉充分溶解并混勻；在7個配制好的管中分別加入1 μL陰性質控品、標準工作品1～6，每個反應管進行充分混勻，每個反應管總體積為50 μL；將混勻的反應管放入RAA-F1620熒光檢測儀中，在39 ℃反應20 min。

1.8 大豆樣品的檢測

取8個反應管，分別按如下操作，吸取27 μL反應緩沖液，加入2 μL探針與引物的混合物，充分混勻；將混勻后的緩沖液49 μL試劑加入到RAA基礎熒光通用反應試劑管中，使凍干粉充分溶解并混勻；在8個配制好的管中分別加入1 μL陰性質控品、經過實時熒光PCR檢測的2份DPC陽性的2份美國大豆、2份阿根廷大豆、2份DPC陰性的巴西大豆的DNA，各1 μL為模板，每個反應管進行充分混勻，每個反應管總體積為50 μL；將混勻的反應管放入RAA-F1620熒光檢測儀中，在39 ℃反應20 min。

2 結果與分析

2.1 引物和探針

上游引物序列5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAG GAAGGTTAGTG-3′；

下游引物序列5′-GCGACGGCAGGTGTGGTAA GAGTGGTGGCGGAAATG-3′；

探針序列及修飾方法為5′-CAGCTGTCTGCGTG CGGCCATTTGCGCCGCA/i6FAMdT//C THF//iBHQdT CACACCTGGAGGCG-3′。

其中，FAM為熒光報告基團，BHQ為熒光淬滅基團，THF為四氫呋喃殘基，修飾方法為FAM：6-Carboxyfluorescein；THF：tetrahydrofuran；BHQ：black hole quencher；phosphate：3′ phosphate to block elongation。

2.2 特異性檢測

用表1中的菌株對設計的引物和探針進行特異性檢測。結果顯示，只有大豆北方莖潰瘍病菌樣本DNA明顯有擴增，其他樣本及陰性質控品均沒有擴增，均為陰性(圖1)。結果表明，本方法特異性好，可以區分大豆北方莖潰瘍病菌的近似種及大豆上常見的病害。

圖1 特異性的檢測結果

2.3 靈敏度檢測

將大豆莖潰瘍病菌DNA質粒制成10倍梯度的工作標準品1～6，用于實時熒光RAA檢測，最快2 min就有明顯擴增，10 min內所有標準工作品均有擴增(圖2)。根據當熒光增加量為熒光起始量的30%為陽性的判定標準，結果表明，該檢測方法的檢測靈敏度達到1.0×103mL-1。

圖2 靈敏度的檢測結果

2.4 大豆樣品的檢測

實際樣品檢測結果表明，陽性對照和美國、阿根廷大豆可見陽性擴增曲線，巴西大豆和陰性對照無擴增信號，說明該方法不但可以用來鑒定大豆北方莖潰瘍病菌菌株，同時也可以用于檢測進出境大豆產品中是否攜帶的大豆北方莖潰瘍病菌，且靈敏度和精確度和實時熒光PCR相當(圖3)。

圖3 大豆樣品的檢測結果

3 討論

大豆(Glycinemax)是我國重要的油料作物和糧食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要來源，在我國國民經濟中占有重要地位。目前我國大豆產量居世界第4位，但仍然不能滿足國內植物油及飼料蛋白加工的需要。隨著我國進口大豆的數量逐年遞增，各種危害大豆生產的病害傳入的風險也逐漸增大。

大豆北方莖潰瘍病菌于1950年在美國愛荷華州首次發現，嚴重危害世界大豆主產區的大豆生產，可以通過種子和混在大豆中的病殘體遠距離傳播[5]。北方莖潰瘍菌的種子侵染率可達10%～20%，因此，隨大豆傳入的可能性極高；深圳、寧波、浙江等口岸曾多次從美國、阿根廷進口的貿易大豆中截獲到大豆北方莖潰瘍病菌[6]。為了保護我國的大豆產業的健康發展，我國將大豆莖潰瘍病菌列入進境檢疫性有害生物名錄，用檢疫方法嚴防其傳入。

目前，檢測大豆北方莖潰瘍病的方法主要有分離培養法、PCR法、LAMP法等[7-8]。傳統方法如分離培養技術耗時較長，操作繁瑣；采用PCR技術，雖然結果精確度高，需昂貴儀器，裝備精良的實驗室和專業的操作人員。LAMP法不需要昂貴的PCR儀，等溫靈敏、特異性強、操作簡單且易于觀察，但是LAMP技術要求多對引物，且對靶基因的要求較高，假陽性高，不利于在基層實驗室推廣使用。本研究首次建立了大豆北方莖潰瘍病菌的RAA檢測方法，克服了以上技術的缺點，并通過樣品的驗證表明，該方法方便快捷、靈敏度高、特異性強，能夠檢測到1.0×103mL-1的DNA樣本，整個檢測過程為5～20 min，能夠滿足進出境大豆及大豆產品快速通關的要求。