miR?154?3p靶向Smad7對人臍靜脈內皮細胞生長、運動及免疫的影響

袁曉麗 1，江莉 1，黃莉莉 1，胡斌

(1.綿陽市中心醫院心血管內科，四川綿陽 621000;2.西南醫科大學附屬醫院心血管內科，四川瀘州 646000)

新生血管形成是腫瘤疾病發生及發展的重要過程，其不僅使腫瘤細胞生長，還能參與腫瘤細胞侵襲、轉移過程[1]。腫瘤生長需要血管內皮細胞的旁分泌作用，而人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)是一種重要的內皮細胞[2]。探究HUVEC的增殖、運動是目前腫瘤研究的熱點之一。近年來，研究顯示micro RNA可參與腫瘤的發生發展過程[3]。miR-154-3p是近年來研究較多的一種micro RNA，Jiang等[4]研究表明，降低miR-154-3p的表達水平會促進乳腺癌細胞的增殖。Fan等[5]研究表明，過表達miR-154-3p可以抑制甲狀腺癌的發展。近年來隨著對腫瘤研究的深入，發現除了micro RNA，Smad蛋白也介導了癌細胞的生長過程。Troncone等[6]研究表明，Smad7在結腸癌細胞中的表達也被上調，為促癌因子。李勇等[7]研究表明，miR-181c靶向作用Smad7調控神經母細胞瘤的生物學特性。因此推測miR-154-3p也可以靶向調控Smad7對HUVEC的相關生物學特征有一定的影響，但目前尚無有關研究。本研究探究了miR-154-3p和Smad7的靶向性，同時分析了miR-154-3p作用后的HUVEC的生長、運動及免疫的機制機理，旨在為相關癌癥的臨床診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要細胞

HUVEC細胞由中國科學院細胞庫提供。

1.2 主要試劑與儀器

TRAIL購自英國Pepro Tech公司；Lipo‐fectamine 2000購自Invitrogen公司；胰蛋白酶購自Biosharp公司；青霉素和鏈霉素購自Solarbio公司；TRAIL購自英國Pepro Tech公司；胎牛血清購自Hyelone公司；孔板購自美國Corning公司；VEGF抗體（貨號：sc-7269）、Smad7抗體（貨號：sc-365846）購自美國Santa Cruz公司；一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS）、白細胞介素-6(interleu‐kin-6,IL-6)、白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)均購自武漢華聯科有限公司。

Transwell小室購自美國Corning Coseter公司；Cubis型模塊化電子天平購自蘇州賽多斯有限公司；SF-TGL-20R型臺式高速冷凍離心機購自上海菲恰爾分析儀器有限公司；WMJ-9688型正置金相顯微鏡購自上海無陌光學儀器有限公司；L00816C型快速智能蛋白印跡儀、L00686C型快速智能蛋白濕轉儀、L00657C型快速智能蛋白染脫色儀均購自南京金斯瑞生物科技有限公司；Leica VT1200型震蕩切片機、CM3050S型冰凍切片機購自德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 常規復蘇HUVEC細胞，分散于包含100 U/mL的青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養基中，置于細胞培養箱中，進行傳代培，養。

1.3.2 分組 取對數期生長HUVEC細胞，分為：Control組、miR-154-3p組、Smad7組和miR-154-3p+Smad7組。

1.3.3 細胞轉染及穩定細胞株構建 miR-154-3p組：將miR-154-3p mimic轉染HUVEC；Smad7組：使用pcDNA3.0構建Smad7過表達載體，并轉染HU‐VEC；miR-154-3p+Smad7組：將miR-154-3p mimic和Smad7過表達載體共轉染HUVEC細胞，根據脂質體轉染實際Lipofectamine 2000說明進行操作，轉染后24 h，篩選穩定的細胞株，Control組僅加入轉染試劑。

1.3.4 RT-PCR檢測miR-154-3p和Smad7的mRNA表達水平 取上述各組HUVEC細胞，采用Trizol提取細胞總RNA，選用兩步法RNA提取試劑盒將RNA轉錄成cDNA。選擇miR-154-3p和Smad7的合適上下游引物，以cDNA為模板采用定量PCR儀擴增，以actin為內參照基因采用2?△△Ct法計算miR-154-3p和Smad7的mRNA的相對表達量。

1.3.5 熒光素酶實驗檢測靶向性 根據NCBI數據庫查詢，采用生物學預測miR-154-3p和Smad7的靶點，miRNA靶點預測軟件提示，miR-154-3p的可能結合位點為Smad7 mRNA的3’UTR位點176～182，體外合成含該位點的DNA片段（wt）以及含該位點突變體（mut）的DNA片段，退火后克隆到雙熒光素酶啟動子載體。將miR-154-3p質粒和Smad7 mRNA分別單獨和共轉染卵HUVEC細胞，孵育48 h后，用熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性，并統計分析結果。

1.3.6 蛋白質印跡法檢測Smad7和VEGF表達水平

取對數期上述各組HUVEC細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，定量后經10%SDS-PAGE電泳轉印到PVDF膜上，使用脫脂奶粉封閉2 h，完成封閉后加入Smad7抗體（稀釋比例1∶500）和VEGF抗體（稀釋比例1∶500），孵育24 h后TBST緩沖液洗滌3次，加入二抗，孵育1 h后TBST緩沖液洗滌3次，ECL顯影劑顯影，以GADPH為內參蛋白，計算Smad7和VEGF蛋白相對表達量。

1.3.7 克隆形成實驗 取對數期上述各組HUVEC細胞，制作成濃度為1×105/mL單細胞懸液，接種于6孔板，100個/孔，置于恒溫細胞培養箱孵育，2周觀察細胞克隆形成情況，加入結晶紫染液染色30 min后拍照。

1.3.8 微管形成實驗檢測細胞增殖實驗 取對數期上述各組HUVEC細胞，用無血清培養基調整濃度至1.2×105/mL后接種于Matrigel人工基質膠與4℃預冷的無血清培養基按1∶1比例混合，接種于24孔板中，1 mL/孔，進行孵育，共16 h，每4 h采用光學顯微鏡（400×）隨機選取5個視野，觀察微管樣結構形成情況并拍照計數。

1.3.9 iNOS、IL-6和IL-10水平 取對數期上述各組HUVEC細胞，制作1×103個/mL單細胞懸液，使用細胞裂解液裂解后，按照iNOS、IL-6和IL-4試劑盒操作說明檢測iNOS、IL-6和IL-4含量水平。

1.3.10 Transwell實驗檢測細胞侵襲情況 取對數期上述各組HUVEC細胞，調節細胞密度為1×105個/mL，100μL基質膠均勻覆蓋于Transwell小室底部，上室加入100μL細胞懸液，下室加入等量含血清培養基。培養24 h后，對侵襲至下室的HUVEC細胞進行結晶紫染色。每組細胞設置3個復孔，隨機選取各組細胞55個高倍鏡視野，拍照并計算侵襲細胞數。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析，采用GraphPad Prism5軟件作圖，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-154-3p和Smad7靶向性檢測

根據NCBI上查詢miR-154-3p上有Smad7的結合位點；采用RT-PCR檢測發現，相比Control組，minic-NC組miR-154-3p和Smad7 mRNA表達差異無統計學意義（P>0.05）；相比Control組，miR-154-3p組miR-154-3p表達顯著升高，Smad7 mRNA表達顯著降低（P<0.05）；野生型miR-154-3p組熒光酶活性顯著低于突變體miR-154-3p組熒光酶活性（P<0.05），表明miR-154-3p上有Smad7的結合位點，見圖1。

圖1 miR-154-3p和Smad7靶向性檢測Figure 1 Targeted detection of miR-154-3p and Smad7

2.2 各組Smad7表達和克隆形成實驗結果

蛋白質印跡實驗檢測Smad7表達情況發現，與Control組相比，pc-DNA組Smad7表達差異無統計學意義（P>0.05）；相比Control組，Smad7組Smad7蛋白相對表達顯著升高（P<0.05）。相比Control組，miR-154-3p組miR-154-3p相對表達顯著升高（P<0.05），Smad7蛋白相對表達和細胞克隆形成率顯著降低（P<0.05）；相比Control組，Smad7組miR-154-3p相對表達顯著降低（P<0.05），Smad7蛋白相對表達和細胞克隆形成率顯著升高（P<0.05）；相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組miR-154-3p相對表達顯著升高（P<0.05），Smad7蛋白相對表達和細胞克隆形成率顯著降低（P<0.05），見圖2。

圖2 各組Smad7表達和克隆形成實驗結果Figure 2 Expression and clone formation of Smad7 in each group

2.3 細胞侵襲狀況檢測結果

Transwell小室實驗檢測發現，相比Control組，miR-154-3p組單位面積細胞侵襲數顯著降低，Smad7組單位面積細胞侵襲數顯著升高（P<0.05）；相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組單位面積細胞侵襲數顯著降低（P<0.05），見圖3。

圖3 細胞侵襲狀況檢測結果Figure 3 Detection of cell invasion

2.4 各組VEGF表達及微管形成實驗檢測結果

蛋白質印跡實驗檢測發現，相比Control組，miR-154-3p組VEGF蛋白相對表達水平和微管形成節點數均顯著降低，Smad7組VEGF蛋白相對表達水平和微管形成節點數均顯著升高（P<0.05）；相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組VEGF蛋白相對表達水平和微管形成節點數均顯著降低（P<0.05），見圖4。

圖4 各組VEGF表達及微管形成實驗檢測結果Figure 4 VEGFexpression and microtubule formation in each group

2.5 各組相關細胞因子表達水平

RT-PCR和ELISA法檢測相關細胞因子水平發現，相比Control組，miR-154-3p組iNOS mRNA和血清iNOS含量水平以及IL-6 mRNA和血清IL-6含量水平顯著降低，IL-10 mRNA和血清IL-10含量水平顯著升高（P<0.05）；相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組iNOS mRNA和血清iNOS含量水平以及IL-6 mRNA和血清IL-6含量水平顯著升高，IL-10 mRNA和血清IL-10含量水平顯著降低（P<0.05），見圖5。

圖5 各組相關細胞因子表達水平Figure 5 Expression of cytokine levels in each group

3 討論

Smad7是Smads家族中抑制型Smads，可以通過TGF-β作用細胞周期，促進細胞進入S期，同時抑制TGF-β下游Rb的磷酸化以及細胞的凋亡，是目前研究較多的一種促癌因子[8]。本研究通過NCBI上查詢發現miR-154-3p上存在Smad7的結合位點，因此推測miR-154-3p可以通過靶向作用于Smad7 mRNA，下調Smad7表達水平實現抑制癌細胞的進展。通過熒光霉素實驗發現野生型miR-154-3p組熒光酶活性顯著低于突變體miR-154-3p組熒光酶活性，說明miR-154-3p確實存在Smad7的結合位點，可以靶向作用降低Smad7的表達水平，為后續研究提供了一定理論基礎。

內皮細胞在血管生成過程中發揮著至關重要的作用，因此，抑制內皮細胞的增殖、遷移，以及誘導其凋亡可以防止血管生成，實現抑制腫瘤的發展[9-10]。因此本研究采用克隆形成實驗檢測了HUVEC細胞的增殖情況，發現相比Control組，miR-154-3p組細胞克隆形成率顯著降低，Smad7組細胞克隆形成率顯著升高。相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組細胞克隆形成率顯著降低。說明miR-154-3p高表達可以抑制HUVEC細胞的增殖，而Smad7高表達則可以促進HUVEC細胞的增殖，miR-154-3p+Smad7可以抑制HUVEC細胞的增殖，結合熒光霉素實驗發現miR-154-3p上存在Smad7的結合位點，可以得出miR-154-3p高表達可以靶向結合Smad7基因使得Smad7蛋白表達水平降低，從而實現抑制HUVEC細胞的增殖。張小平等[11]研究表明，Smad7的高表達可以促進腫瘤的發展，與本研究得出的結論一致。

抑制HUVEC細胞的增殖可以影響腫瘤的發展，HUVEC細胞的侵襲和遷移同樣會影響到腫瘤細胞的發展[12]。本研究為檢測HUVEC細胞的侵襲能力，采用Transwell小室實驗檢測了HUVEC細胞的侵襲能力，發現miR-154-3p高表達細胞的侵襲能力顯著降低，而Smad7高表達會使得HUVEC細胞的侵襲能力顯著增強，共轉組的HUVEC細胞的侵襲能力又有一定程度的減弱，結合前面研究，發現miR-154-3p上存在Smad7的結合位點，可以得出miR-154-3p可以靶向作用于Smad7 mRNA，干擾Smad7表達從而抑制HUVEC細胞的侵襲能力。為探究其機制，本文深入研究了與腫瘤細胞侵襲能力相關的蛋白表達情況。VEGF是一種血管內皮生長因子，可以促進新血管的生長[13]。本研究檢測發現下調Smad7的表達可以顯著抑制其表達，說明miR-154-3p靶向作用Smad7可以抑制血管內皮生長因子達到抑制其增長的效果。

腫瘤細胞的增殖與炎癥關系也較為密切，炎癥反應參與了大多數腫瘤的發展過程[14]。炎癥因子包含促炎癥因子和抑炎癥因子兩大類，促炎癥因子主要由TH1細胞分泌，包含TNF-α、IL-17、IL-23等[15]；而抑炎癥因子則由主要由TH2細胞分泌，包含IL-10、IL-4、IL-13等[16]。本研究發現miR-154-3p高表達的相關抑炎癥因子表達升高，促炎癥因子表達降低，這也符合前面所得結論miR-154-3p高表達可以靶向作用Smad7的表達抑制腫瘤細胞的發展。楊曉宇等[17]研究表明：炎癥因子在腫瘤的發展中起著重要的作用，抑制炎性因子的分泌可以一定程度上抑制腫瘤的發展。

綜上所述，miR-154-3p過表達可以靶向結合Smad7，有效抑制HUVEC的增殖和運動能力。