麩炒枳實炮制工藝研究及質量分析

彭致鋮，蔡盛康，羅思妮，魏梅，孫冬梅，朱德全

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244）

枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞的功效。枳實歷代有清炒、炒黃、炒黑、麩炒、面炒、醋炒、酒炒、土炒、蜜炙等多種炮制方法。歷代醫藥典籍中枳實使用主要以炒（炙）或麩炒為主，臨床上多以麩炒枳實入藥。枳實主要含揮發油、黃酮類化合物和辛弗林等化學成分，其中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黃酮類化合物屬于枳實的有效成分，辛弗林屬于枳實的活性成分[1-3]。辛弗林對于胃、腸運動具有調節作用，有較強的擴張氣管和支氣管的作用[4]。謝杞等[5]研究發現，辛弗林對CUMS大鼠具有抗抑郁的作用。2020版《中國藥典》中僅收載了麩炒枳實，且只規定了輔料用量范圍，無具體炮制工藝參數[6]，故有必要對麩炒枳實炮制工藝進行優化。本研究以特征圖譜作為定性指標，飲片性狀為炮制程度判斷指標，柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林質量分數作為定量指標，采用L9（34）因素水平表與主成分分析法，優選麩炒枳實最佳炮制工藝，以期為其大生產的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Arc高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；XP26百萬分之一天平、ME204E萬分之一天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；HF-25型多功能炒果子機（萬江富順機械廠）。

1.2 試藥

辛弗林（批號：1107023-201608）、柚皮苷（批號：110722-201714）、橙皮苷（批號：110721-201617）、新橙皮苷（批號：111857-201703）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；液相色譜用甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。

1.3 樣品

15批枳實藥材采自江西吉安市、九江市、宜春市與湖南益陽市，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果。15批藥材與輔料經廣東一方制藥有限公司質量中心檢測，均符合2020版《中國藥典》規定，詳見表1。

表1 15批枳實生品、炮制品樣品信息Table 1 The Information of 15 batches of raw Fructus Aurantii immaturus and processed products

2 方法與結果

2.1 麩炒枳實特征圖譜與黃酮類質量分數的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：224 nm；進樣量：對照品溶液10μL，供試品溶液5μL；乙腈為流動相A，0.1%磷酸和0.05%十二烷基硫酸鈉溶液為流動相B，梯度洗脫程序詳見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林對照品適量，置50 mL量瓶中，加50%（體積分數，下同）甲醇溶解并稀釋至刻度，即得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林質量濃度分別為0.038、0.051、0.054、0.042 mg/mL的混合對照品溶液。

另精密稱取柚皮苷、新橙皮苷對照品適量，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得柚皮苷、新橙皮苷質量濃度分別為0.113、0.110 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過65目篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4 .1 標準曲線 精密吸取質量濃度為18.08、72.33、144.65、289.31、578.63、1 157.25μg/mL的柚皮苷對照品溶液10μL與質量濃度為19.06、76.23、152.45、304.91、609.82、1 219.64μg/mL的新橙皮苷對照品溶液10μL，按“2.1.1 ”項色譜條件測定，以對照品的量對峰面積進行回歸分析，得柚皮苷回歸方程y=15 040x+56 907（r2=0.999 3），新橙皮苷回歸方程y=12 065x+167 573（r2=0.999 6），柚皮苷在18.08～1 157.25μg/mL范圍內具有良好相關性，新橙皮苷在19.06～1 219.64μg/mL范圍內具有良好相關性。2.1.4 .2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1 ”項色譜條件測定，重復進樣6次，以新橙皮苷峰為參照峰，計算其余各特征峰相對峰面積RSD值為0.29%，柚皮苷RSD為1.03%，新橙皮苷RSD為0.89%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 .3 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1 ”項色譜條件，分別于0、3、6、9、12、18、24 h測定。以新橙皮苷峰為參照峰，計算其余各特征峰相對峰面積RSD值為1.48%，柚皮苷RSD為1.22%，新橙皮苷RSD為1.22%，表明供試品溶液在24 h內穩定。2.1.4 .4 重復性試驗 精密稱取麩炒枳實樣品6份，分別按“2.1.3 ”項方法制備供試品溶液，按“2.1.1 ”項下色譜條件測定，以新橙皮苷峰為參照峰，計算其余各特征峰相對峰面積RSD值為1.00%，柚皮苷RSD為0.52%，新橙皮苷RSD為0.48%，表明樣品具有良好的重復性。

2.1.4 .5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量麩炒枳實樣品9份，每份0.2 g，分別加入柚皮苷、新橙皮苷對照品適量，分別按“2.1.3 ”項方法制備供試品溶液，按“2.1.1 ”項色譜條件測定，結果測得柚皮苷平均加樣回收率為100.84%，RSD為0.94%，新橙皮苷平均加樣回收率為98.54%，RSD為0.76%，表明方法準確性良好。

2.1.5 特征圖譜的建立 吸取“2.1.2 ”項下柚皮苷、橙皮苷、新橙皮與辛弗林混合對照品溶液和“2.1.3 ”項下供試品溶液和空白溶劑各5μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。經與對照品進行比較，確認峰3為柚皮苷、峰4為橙皮苷、峰5為新橙皮苷、峰7為辛弗林。

圖1 麩炒枳實特征圖譜Figure 1 The characteristic chromatograms of stir-fried Fruc‐tus Aurantiiimmaturus with bran

2.1.6 枳實特征圖譜共有模式的建立 取“1.3”項15批不同來源的枳實與麩炒枳實，按“2.1.3 ”項方法制備供試品溶液，再按“2.1.1 ”項色譜條件進行測定。將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，選擇7個峰面積穩定且分離度較好的色譜峰，確定其為共有峰。15批枳實與麩炒枳實HPLC特征圖譜疊加圖見圖2和圖3。

圖2 15批枳實特征圖譜共有模式Figure 2 The common pattern of 15 batches of Fructus Aurantiiimmaturus

圖3 15批麩炒枳實特征圖譜共有模式Figure 3 The common pattern of characteristic chromato‐grams of 15 batches of stir-fried Fructus Aurantiiimma‐turus with bran

2.2 麩炒枳實中辛弗林質量分數的測定

精密稱取麩炒枳實粉末，參照2020年版《中國藥典》一部枳實項下辛弗林質量分數測定方法進行測定[6]，色譜圖見圖4。

圖4 辛弗林質量分數測定色譜圖Figure 4 The chromatograms of synephrine

2.3 麩炒枳實炮制工藝研究

2.3.1 正交試驗設計 取其中一批大小均勻的枳實飲片，均分成9份，每份取150 g，準確稱定，分別加入適量麥麩，炒至色變深，即得。以炒制溫度、炒制時間與加麩量為考察因素，按L9（34）因素水平表設計，各因素與水平見表3。

表3 正交設計表因素與水平Table 3 The factors and levels of Orthogonal design

2.3.2 正交試驗方法與結果 將炒藥機加熱至設定溫度，均勻撒入定量麥麩，即刻煙起，投入凈枳實片，快速翻動，炒至色變深，取出，篩去麥麩，即得[6]。

采用綜合評分法，將9次試驗中柚皮苷質量分數最高的試驗數據定為100，其他各次試驗數據與其相比即為得分，同法進行新橙皮苷與辛弗林的評分。將9次試驗中所得飲片性狀與2020年版《中國藥典》麩炒枳實項下所描述性狀對比，選擇3～5人作出評分，取平均值。2020年版《中國藥典》對麩炒枳實的性狀與辛弗林質量分數均有規定且辛弗林為枳實主要活性成分，對胃腸運動具有調節作用，故加權系數均為0.3，柚皮苷與新橙皮苷質量分數加權系數均為0.2。將4個指標通過加權系數計入綜合評分，由綜合評分確定所選指標的優劣，結果見表4。直觀分析見表5，方差分析見表6。

從表4的直觀分析數據可以看出，影響因素對極差R的影響順序從大到小為因素A>因素B>因素C>空白，即炒制溫度>炒制時間>加麩量>空白；結合各因素水平，最佳工藝參數為A1B1C3。

表4 麩炒枳實炮制正交設計試驗結果Table 4 he results of orthogonal design for processing of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

從表5方差分析數據可以看出，炒制溫度對麩炒枳實炮制質量的影響有統計學意義（P<0.05），而炒制時間與加麩量則無統計學意義。

表5 方差分析表Table 5 Analysis of Variance Table

綜上所述，由于加麩量對麩炒枳實炮制無明顯影響，再結合傳統經驗及大生產經濟性考慮，確定最佳工藝參數為A1B1C1，即每100 kg麩炒枳實用麥麩量為10 kg，炒制溫度為220℃，炒制5 min。

2.3.3 主成分分析 以新橙皮苷為參照峰，其余6個特征峰的相對峰面積為變量，采用SPSS21.0軟件進行主成分分析，得特征值和方差貢獻率見表6，碎石圖見圖5。可見，以特征值＞1并考慮碎石圖連續陡峭部分，可以提取得到2個主成分，累計方差貢獻率為83.114%，說明這2個成分可以代表83.114%的信息，具有良好的代表性。因子載荷矩陣見表7，從中可見，峰1、柚皮苷、辛弗林對主成分1貢獻較大，峰2對主成分2貢獻較大。

圖5 麩炒枳實主成分分析碎石圖Figure 5 The Gravel map of principal component analysis of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

根據表6和表7的數據，將原始數據標準化后，進一步計算得到2個主成分得分的特征向量，將其與標準化數據相乘后得到2個主成分得分F1、F2：

表6 麩炒枳實主成分分析特征值與方差貢獻率Table 6 Principal component analysis eigenvalue and variance contribution rate of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

表7 因子載荷矩陣Table 7 Factor load matrix

F1=0.518ZX1+0.174ZX2+0.530ZX3+0.188ZX4+0.329ZX5+0.525ZX6，

F2=0.077ZX1+0.659ZX2+0.010ZX3+0.408ZX4?0.623ZX5?0.060ZX6，

式中：ZX1～ZX6分別為峰1（X1）、峰2（X2）、柚皮苷（X3）、橙皮苷（X4）、峰6（X5）、辛弗林（X6）的標準化數據。

以各主成分得分所對應的方差貢獻率為系數，從而得到綜合評分模型F，F表達式為：F=0.583 34F1+0.247 80F2。9次實驗綜合得分見表8。綜合得分排名最高的為1號實驗，與正交實驗方差分析得出結果一致。最終確定最優炮制工藝參數為每100 kg麩炒枳實用麥麩量為10 kg，炒制溫度為220℃，炒制5 min。

表8 主成分綜合得分排名Table 8 Comprehensive score ranking of main componen

2.3.4 工藝驗證

取枳實飲片，按上述最佳工藝參數，重復制備麩炒枳實飲片3份，按上述方法測定，測定其特征圖譜和柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林的質量分數，見表9。結果表明，麩炒枳實炮制工藝參數重復性良好。

表9 麩炒枳實中3種成分質量分數的測定結果Table 9 Determination of the mass fraction of three compo‐nents in stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

2.3.5 生品與炮制品的差異分析

取15批不同產地枳實藥材，按上述最佳工藝參數，制備15批麩炒枳實飲片，按“2.1.3 ”項方法制備供試品溶液，再按“2.1.1 ”項色譜條件進行測定，以新橙皮苷為參照峰，計算其余各峰的相對峰面積，結果見表10～表11。

表10 枳實藥材特征圖譜相對峰面積Table 10 Relative peak area of the characteristic chromatogramsof Fructus Aurantiiimmaturus

表11 麩炒枳實飲片特征圖譜相對峰面積Table 11 Relative peak area of characteristic chromatograms of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

對比15批不同產地枳實與麩炒枳實的特征圖譜的結果發現，經過麩炒后，未知成分峰1除個別批次外，相對峰面積均有不同程度的降低；未知成分峰6除個別批次外，相對峰面積均有不同程度的增加，說明枳實與麩炒枳實化學成分比例存在一定的差異。有研究表明枳實麩炒后揮發油的含量有所減少，而揮發油組分與其他主要化學成分變化不大[7-8]。

3 討論

本研究比較了不同的流動相體系（乙腈-0.1%甲酸和0.1%十二烷基硫酸鈉、乙腈-0.1%磷酸和0.1%十二烷基硫酸鈉、乙腈-0.1%磷酸和0.05%十二烷基硫酸鈉）、不同提取方式（超聲、回流）、不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇）、不同提取時間（15 min、30 min、60 min）、不同提取溶劑用量（50 mL、100 mL），結合柚皮苷、新橙皮苷質量分數與各色譜峰數量和分離效果考慮，最終確定用甲醇超聲提取供試品溶液，以乙腈-0.1%磷酸和0.05%十二烷基硫酸鈉為流動相的色譜條件。色譜柱選擇能較好分離堿性化合物與耐高水相的Waters Sym‐metry色譜柱，能實現對麩炒枳實中的黃酮和生物堿（辛弗林）的同時分離。

本研究從枳實及麩炒枳實的HPLC特種圖譜中標識出7個共有峰，通過對照品指認了其中4個成分，分別為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林。通過15批不同產地的枳實與麩炒枳實的特征圖譜可知，枳實經過炮制后并無化學成分消失或產生新的物質，但未知成分峰1除個別批次外，相對峰面積均有不同程度的降低，推測峰1為揮發油成分，經麩炒后達到“緩和其峻烈之性[9]”的效果；未知成分峰6除個別批次外，相對峰面積均有不同程度的增加，推測未知成分峰6與麩炒枳實的藥效“以散積消痞力勝[9]”有關。但對于具體的化學成分的變化與緩和枳實的破氣之功的關系，還有待進一步研究。

目前，對麩炒枳實炮制工藝研究已有文獻報道[1,10-11]，但因年代較久，參考《中國藥典》的版本不一，導致得出的結論已不符合2020年版《中國藥典》炮制通則項下的規定。本研究參考2020年版《中國藥典》，通過正交實驗方差分析與主成分分析，優選出麩炒枳實炮制工藝，且炮制考察所用的炒藥機是模擬的大生產炮制設備，對麩炒枳實大生產的質量控制具有一定的指導性。