生物信息學分析線粒體基因在前列腺癌生化復發(fā)中的作用

韓兆冬，鄧煜麟，馮源發(fā)，蔡尚樺，唐鎮(zhèn)鋒，鐘惟德

（廣州市第一人民醫(yī)院/華南理工大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州 510180）

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內位居男性惡性腫瘤第2位[1]。在我國，前列腺癌則位居發(fā)病率第6位，死亡率第10位，其5年生存率遠低于美國[2]。隨著前列腺腫瘤早期篩查的推廣，更多的早期前列腺癌患者被確診，接受根治性切除手術治療后可獲得良好的預后。但仍有相當多的患者在確診前列腺癌時已經(jīng)失去手術的機會，并且在接受內分泌治療一段時間后，出現(xiàn)生化復發(fā)，預后欠佳。因此，急需尋找新的生物標記物為前列腺癌的早期治療提供新的治療靶點。

眾所周知，大多數(shù)癌細胞依賴于有氧糖酵解產生能量的Warburg效應。然而，與大多數(shù)依賴有氧糖酵解的癌細胞不同，前列腺癌細胞與良性細胞相比，其表現(xiàn)出在線粒體中更活躍的檸檬酸循環(huán)活性[3]。為此，我們通過公共數(shù)據(jù)庫下載前列腺癌患者的腫瘤測序及臨床信息進行分析，以探討線粒體基因與前列腺癌患者生化復發(fā)的相關性，并分析其在前列腺癌生化復發(fā)中發(fā)揮作用的信號通路。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

TCGA公共數(shù)據(jù)庫（TCGA-PRAD，https://www.cancer.gov/tcga)下載498名前列腺癌患者轉錄組數(shù)據(jù)和相應的臨床數(shù)據(jù)。BROAD公共數(shù)據(jù)庫（https://www.broadinstitute.org/mitocarta）下載MitoCarta3.0數(shù)據(jù)集，其中包含1 135個編碼人類線粒體蛋白的基因。

1.2 基因篩選

通過生存分析篩選出生化復發(fā)具有統(tǒng)計學差異的基因，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。利用在線生物信息學分析網(wǎng)站VENNY（https://bioin‐fogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對前列腺癌生化復發(fā)相關基因以及線粒體基因進行交集分析，獲得具有前列腺癌生化復發(fā)意義的線粒體基因。

1.3 基因相關性分析

利用在線生物信息學分析網(wǎng)站STRING（https://string-db.org）分析篩選出來具有前列腺癌生化復發(fā)意義的線粒體基因之間的蛋白質-蛋白質相互作用。Cytoscape 3.7.2 軟件對STRING的結果進行網(wǎng)絡圖的可視化并篩選出互作網(wǎng)絡中關系最密切的前20個基因。

1.4 基因富集及功能分析

利用網(wǎng)站METASCAPE（https://metascape.org），通過基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），對具有前列腺癌生化復發(fā)意義的線粒體基因進行功能分析并預測其發(fā)揮作用的信號通路。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌患者生化復發(fā)相關的線粒體基因

在TCGA-PRAD公共數(shù)據(jù)庫中，篩選出3 035個與前列腺癌生化復發(fā)相關的差異基因。為了探討線粒體相關基因在前列腺癌生化復發(fā)中的作用，結合MitoCarta3.0數(shù)據(jù)集中1 135個編碼線粒體蛋白的基因，使用VENNY網(wǎng)站進行交集分析（圖1），結果提示有141個具有前列腺癌生化復發(fā)意義的線粒體基因，基因名如下：

圖1 篩選具有前列腺癌生化復發(fā)意義的線粒體基因Figure 1 Screening of mitochondrial genes for biochemical recurrence of PCa

ABAT、ABCB6、ABCB7、ACACA、ACAD11、ACAD8、ACAD9、ACOT13、ACSF3、ACSL6、ADCK5、AGK、AKR7A2、ALDH2、ALDH3A2、ALDH6A1、AL‐DH7A、ALKBH1、ALKBH7、ATPAF2、AURKAIP1、BCAT2、BCL2L11、BNIP3L、PRXL2A、CMC2、TEFM、SEPTIN4、SMDT1、NOA1、SMIM8、CA5B、CCDC127、CCDC51、CDK5RAP1、CLYBL、COM‐TD1、COMT、COQ9、COX4I1、COX6B2、CPOX、CPT1C、CPT2、CS、CYB5B、DAP3、DCXR、DGUOK、DHRS7B、DNA2、ECH1、ECHDC1、ECHDC3、ECHS1、ECSIT、EPHX2、FDX1、FKBP10、FKBP8、GCAT、GCDH、GDAP1、GLOD4、GLS、GSTZ1、GT‐PBP10、GTPBP3、HARS2、HIBADH、HINT2、HMG‐CL、HMGCS2、HSCB、HSDL1、HTRA2、IMMT、LETM1、LIG3、LRPPRC、MCAT、MCEE、MLYCD、MMAB、MOCS1、MPST、MRM1、MRPL17、MRPL20、MRPL40、MRPL54、MRPS18A、MRPS26、MSRA、MTHFD1L、MYO19、NDUFA13、NDUFA9、NDUFS5、NDUFV2、NGRN、NIPSNAP3B、NUDT8、OPA1、PARK7、PCCA、PDF、PGS1、PIF1、POLG2、POLQ、PPM1K、PPOX、PTCD1、PTCD3、PTPMT1、SARS2、SCP2、SLC25A11、SLC25A13、SLC25A36、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A4、SOD2、SPRYD4、STX17、SU‐CLA2、TARS2、TFB2M、THEM4、TIMM22、TMEM11、TMEM14C、TMEM65、TRAP1、TST、TXN2、UCP3、VARS2、XPNPEP3。

2.2 前列腺癌生化復發(fā)相關線粒體基因的蛋白質-蛋白質相互作用

首先利用STRING網(wǎng)站，初步得到上述141個基因之間的相互作用關系，再通過Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡圖的可視化（圖2A），篩選出互作網(wǎng)絡中關系最密切前20個基因（圖2B、圖2C）分別是SOD2、CS、COX4I1、ECHS1、HMGCL、PTCD3、CPT2、NDU‐FA9、HIBADH、ALDH6A1、PARK7、PCCA、NDUFV2、MRPL17、DAP3、ACSF3、AURKAIP1、MRPL20、MD‐UFA13及MRPL40。

圖2 前列腺癌生化復發(fā)相關線粒體基因之間的蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡。Figure 2 Protein-protein interaction network among mitochondrial genes related to biochemical recurrence of PCa

2.3 探究前列腺癌生化復發(fā)相關線粒體基因發(fā)揮作用的機制

GO富集分析從生物學過程（圖3A）、細胞成分（圖3B）和分子功能（圖3C）3個方面預測這些基因的功能作用，結果顯示這些基因主要參與線粒體基質和線粒體膜（圖3B，GO:0005759，GO:0031966，GO:0044455）的組成，影響線粒體的組成及其自身基因的表達，參與有機酸、脂肪酸等物質的代謝（圖3A，GO:0007005，GO:0140053，GO:0016054，GO:0006631），調控氧化還原反應（圖3C，GO:0016491）。KEGG分析結果顯示前列腺癌生化復發(fā)相關線粒體基因發(fā)揮生物作用的12條信號通路中，篩選的基因主要參與丙酮代謝及脂肪酸代謝通路（圖4，ko00640，ko:00071，hsa01212）。

圖3 前列腺癌生化復發(fā)相關線粒體基因的功能預測Figure 3 Function prediction of mitochondrial genes related to biochemical recurrence of PCa

圖4 KEGG預測前列腺癌生化復發(fā)相關線粒體基因富集的信號通路Figure 4 Prediction of the signaling pathway of mitochondrial genes related to biochemical recurrence of PCa by KEGGanalysis

3 討論

失去根治性手術治療機會的前列腺癌患者在接受抗雄激素的去勢治療初期，可以獲得癌灶縮小、前列腺特異性抗原（PSA）下降的良好治療效果。但大多數(shù)患者經(jīng)過內分泌治療后出現(xiàn)雄激素維持在去勢水平，但PSA再次升高的情況，此時可認為患者出現(xiàn)生化復發(fā)的病情進展，預后較差。

對腫瘤代謝的研究始于20世紀中葉，Warburg[4]提出惡性腫瘤細胞即使在充分的氧氣供應下，葡萄糖優(yōu)先合成代謝為丙酮酸，然后再轉化為乳酸。此后，大量研究指出能量代謝異常在促進腫瘤生成及轉移中發(fā)揮重要作用。

良性前列腺細胞通過積累鋅抑制檸檬酸循環(huán)活動。然而，前列腺癌細胞并不依賴于有氧糖酵解以產生能量，反而通過消耗細胞內的鋅以解除對檸檬酸循環(huán)的抑制作用[5]。為此，我們針對線粒體基因對于前列腺癌生化復發(fā)的意義進行研究，結果發(fā)現(xiàn)有141個編碼線粒體蛋白的基因對于前列腺癌患者生化復發(fā)有統(tǒng)計學意義，其主要編碼線粒體基質及線粒體膜等線粒體組分，提示線粒體結構異常可能影響前列腺癌患者生化復發(fā)的風險。研究結果表明，調控線粒體形態(tài)變化將影響腫瘤的生長。調控肺癌細胞線粒體形態(tài)使其裂解狀態(tài)增強，可以導致肺癌細胞的細胞周期阻滯并抑制其在裸鼠中的生長[6]。此外，增強Hela細胞的線粒體裂解狀態(tài)，可促進細胞的凋亡[7]。本研究通過富集分析發(fā)現(xiàn)上述基因主要富集在丙酮及脂肪酸代謝的生物進程中，參與調控氧化還原活動。多項研究提示脂質代謝異常可促進前列腺癌進展，前列腺癌細胞通過過表達如脂肪酸合成酶（FASN）、固醇調節(jié)元件結合蛋白1（SREBP1）和固醇輔酶A去飽和酶等產生新生脂質的關鍵蛋白[8]，也可以利用從頭合成的脂肪酸來獲得能量[9]。Yoshiii等[10]認為前列腺組織中不受調控的FASN活性本身就是惡性表型的開始，并認為是維持前列腺癌生長所必需的。通過相關性分析，發(fā)現(xiàn)SOD2、CS、COX4I1、ECHS1、HMGCL、PTCD3、CPT2、NDUFA9、HIBADH、ALDH6A1、PARK7、PC‐CA、NDUFV2、MRPL17、DAP3、ACSF3、AURKAIP1、MRPL20、MDUFA13及MRPL40在此進程中發(fā)揮重要作用，但具體仍需要進一步的研究。

上述結果表明，線粒體基因在前列腺癌生化復發(fā)中起著重要作用，這些基因調控線粒體的結構，在功能上，其通過調控丙酮及脂肪酸代謝影響氧化還原反應。此外，我們篩選了20個高相關性基因，可能成為潛在的早期診斷及治療的靶點。