阿里紅多糖對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究

姜曉杰，吉家興

（廣東省第二人民醫院藥學部，廣東廣州 510317）

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/re‐perfusion injury，MIRI）是指心肌血液供應中斷，而心肌一定時間內恢復血流，但原缺血心肌出現較缺血前更為嚴重的損傷。再灌注心臟伴隨而來的病理變化有心率失常、舒縮障礙、代謝異常和超微結構改變等[1]。其發病機制復雜，仍需進一步的研究探討。有研究[2-5]表明其發病機制可能與氧化應激、炎癥反應、Ca2+超載、細胞凋亡和自噬等多方面相關。阿里紅（Fomes off icinalis Ames）作為一種多孔菌科層孔菌屬干燥子實體，其有著廣泛的民族用藥基礎，是我國新疆地區常用的道地藥材。據醫書記載其具有溫胃祛痰、祛風除濕、消腫利尿、降氣平喘的功效，臨床上常用于慢性支氣管炎、腹痛、感冒、癌癥等疾病的治療。阿里紅多糖是其主要有效成分之一。阿里紅多糖具有較好的抗炎、抗氧化和抗凋亡活性[6-8]。目前，阿里紅多糖對MIRI的作用尚未見相關研究報道。本研究擬以大鼠MIRI模型為研究對象，觀察阿里紅多糖對心肌缺血再灌注損傷的影響，并以凋亡信號通路Bax/Bcl-2/Caspase-3為靶點探究其抗MIRI的作用機制。

1 材料

1.1 儀器與試劑

BL-420F生物機能實驗系統，成都泰盟科技有限公司；小動物呼吸機，上海軟隆科技發展有限公司；阿里紅，寧波德康生物制品有限公司；氯化硝基四氮唑藍(NBT），上海弘順生物科技有限公司；地塞米松片：規格：0.75 mg/片，廣東南國藥業有限公司；羊抗鼠Bcl-2和羊抗鼠caspase-3一抗，碧云天生物技術有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒，齊一生物科技（上海）有限公司。

1.2 動物與分組

SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量180～220 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(粵)2014-0005。大鼠適應性喂養2周后，按體質量隨機分為6組，分別為假手術組、模型組、DEX組、ALH-L組、ALH-M組和ALH-H組，每組10只。各給藥組于造模前預防給藥1周，除假手術組和模型組灌胃給予等量生理鹽水外，其中DEX組灌胃給予地塞米松0.8 mg/(kg·d)，ALH-L、M、H組分別灌胃給予阿里紅多糖10、20、40 mg/(kg·d)。

2 方法

2.1 阿里紅多糖提取方法

主要參照文獻[9]的方法提取阿里紅多糖，主要方法如下：粉碎機粉碎阿里紅1 kg，烤箱中60℃干燥至恒重。稱取500 g置于回流提取器中，加入95%（φ）乙醇2 000 mL，回流提取4 h，過濾，保留濾液。再加入95%乙醇1 000 mL回流提取藥渣3次，每次提取1 h，過濾。藥渣再用60℃熱水回流提取3次。先加蒸餾水1 000 mL，60℃下提取4 h再加入500 mL蒸餾水2次，分別提取1 h。合并提取液，離心除去沉淀。將上述合并的提取液采取減壓濃縮方法減至100 mL，隨后加入無水乙醇使其含醇量達80%，置于4℃環境過夜。取出提取液抽濾，使用95%乙醇、無水乙醇、丙酮和乙醚分別洗滌沉淀3次，每次50 mL，于干燥箱內50℃干燥，產物為阿里紅多糖，共4.2 g。將阿里紅多糖加水溶解，以硫酸-苯酚法測定測得多糖百分含量為85.52%，即每克阿里紅含多糖7.18 mg。

2.2 大鼠MIRI模型的建立

大鼠腹腔注射2%異戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，仰臥固定，行氣管插管并連接呼吸機（潮氣量為4 mL/100 kg，呼吸頻率為60次/min，呼吸比為1.2∶1），Ⅱ導聯心電圖監測，連續記錄。于大鼠胸骨左緣第3與4肋之間開胸，小心暴露心臟。用無創縫合線6/0絲線在LAD下穿處，于左心房與肺動脈圓錐之間處結扎，阻斷血流，結扎缺血30 min后開胸及剪斷結扎線，再灌注23.5 h，術后注射青霉素防止感染。結扎成功標準：肉眼可見結扎線下心臟左室壁變暗變紫，心尖部變白，心電圖示ST段明顯上抬。再灌注成功的標準:左心室變紅潤，ST段回落。假手術組只穿線不結扎。

2.3 大鼠心臟梗死率檢測

小心摘取心臟，生理鹽水沖洗干凈，切取心臟結扎線以下部分，切取2 mm的心肌組織，使用1%NBT染液于37℃孵育染色20 min，中性甲醛固定，拍照，應用Image-Pro Plus軟件分析，梗死率=梗死面積/總面積×100%。

2.4 生化指標和Western blot檢測

按照試劑盒說明書使用酶標儀檢測血漿CK、LDH、SOD活性和TNF-α、IL-1β、MDA含量。提取缺血心肌組織中的總蛋白，按常規Western blot檢測步驟檢測Bcl-2和caspase-3的表達量，在凝膠成像系統中進行灰度值的計算和分析。

2.5 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行分析。所有實驗數據計量資料用x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 阿里紅多糖對大鼠MIRI模型心電圖的影響

與假手術組比較，模型組心電圖ST段顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組心電圖ST段顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組心電圖ST段顯著降低（P<0.01）。見圖1、2。

圖1 心電圖變化Figure 1 Change of electrocardiogram

圖2 ST段上抬量Figure 2 Lifting of ST segment

3.2 阿里紅多糖對大鼠MIRI模型心臟梗死率的影響

模型組心臟梗死率較假手術組顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組心臟梗死率顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組心臟梗死率顯著降低（P<0.05）。見圖3、4。

圖3 各組心臟梗死面積變化(NBT染色)Figure 3 Changes of cardiac infarction area in each group(NBTstaining)

3.3 阿里紅多糖對大鼠MIRI血漿CK和LDH活性的影響

與假手術組比較，模型組CK和LDH活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組CK和LDH活性顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組CK和LDH活性均顯著降低（P<0.05）。見圖5、6。

圖5 各組血漿CK活性變化（x±s）Figure 5 Changes of plasma CK activity in each group(x±s)

3.4 阿里紅多糖對大鼠MIRI血漿TNF-α和IL-1β含量的影響

圖4 各組心臟梗死率變化Figure 4 Change of cardiac infarction rate

圖6 各組血漿LDH活性變化（x±s）Figure6 Changesof plasma LDHactivity in each group(x±s)

與假手術組比較，模型組TNF-α和IL-1β含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組TNF-α和IL-1β含量顯著降低（P<0.05）；與DEX組比較，ALH-H組TNF-α和IL-1β含量顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組TNF-α和IL-1β含量顯著降低（P<0.05）。見圖7、8。

圖7 各組血漿TNF-α含量變化（x±s）Figure7 Changesof plasmaTNF-αcontentineachgroup(x±s)

2.5 阿里紅多糖對大鼠MIRI血漿SOD和MDA的影響

模型組SOD活性較假手術組顯著降低，MDA含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組大鼠SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組大鼠SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P<0.05）。見圖9、10。

圖9 各組血漿SOD活性變化（x±s，U/mL）Figure 9 Changes of plasma SOD activity in each group(x±s,U/mL）

2.6 阿里紅多糖對大鼠MIRI心肌缺血組織Bcl-2和caspase-3表達的影響

圖8 各組血漿IL-1β含量變化（x±s）Figure8 Changesof plasma IL-1βcontentineachgroup(x±s)

圖10 各組血漿MDA含量變化（x±s）Figure 10 Changes of plasma MDA content in each group(x±s)

與假手術組比較，各組caspase-3表達量顯著升高，而Bcl-2表達量顯著降低（P<0.01）；與模型組相比較，DEX組和ALH給藥組caspase-3表達量顯著降低，Bcl-2表達量顯著升高（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組caspase-3表達量顯著降低，Bcl-2表達量顯著升高（P<0.05）。見圖11。

圖11 各組心肌缺血組織Bcl-2和caspase-3的表達（x±s）Figure 11 Expression of Bcl-2 and caspase-3 in myocardial ischemia tissues of each group(x±s)

3 討論

目前，溶栓治療實現血流再通是臨床上防治急性心肌梗死的主要方案，但由此引起的再灌注損傷嚴重影響患者的預后，其發病機制至今尚未完全闡明。有研究[2-5]表明其發病機制可能與氧化應激、炎癥反應、Ca2+超載、細胞凋亡和自噬等多方面相關。地塞米松是一種具有強大的抗炎、抗免疫和抗休克等多種藥理作用的甾體類糖皮質激素，但如長期大劑量使用，可引起較多的不良反應。較多研究發現[10-12]地塞米松可改善MIRI相關癥狀，如心律失常、心臟梗死率等，故本研究選擇地塞米松作為陽性對照藥。

阿里紅多糖具有較好的抗炎、抗氧化和抗凋亡活性。此外，其毒性較小。有研究[13]報道小鼠口服阿里紅多糖，其半數致死量(LD50)為6.31 g/kg。目前阿里紅多糖對MIRI的研究未見到相關報道，本研究發現阿里紅多糖具有確切的抗大鼠MIRI作用。心肌損傷或者壞死后，心肌會釋放CK和LDH入血，血清CK和LDH活性會顯著升高。故臨床上常采用CK、LDH活性來評價MIRI患者心肌細胞損傷的嚴重程度及愈后，而心臟梗死面積可作為心肌細胞損傷比較直觀的評價指標。本研究發現模型組心肌梗死率、CK和LDH活性顯著升高，提示大鼠MIRI造模成功，給阿里紅多糖可有效保護缺血心肌，降低心肌梗死率和CK、LDH活性。TNF-α與IL-1β是兩種具有重要生物活性的細胞因子。兩者參與了炎癥所致心肌損傷的整個病理過程，其水平高低反映機體的炎癥水平。本研究發現阿里紅多糖可明顯減輕炎癥，呈劑量依賴性，提示阿里紅多糖可能通過抗炎作用減輕MIRI。SOD可清除機體H2O2和OH·等氧自由基，保護機體免受氧自由基的損害。MDA是機體膜脂過氧化過程中所產生的一種毒性醛類物質，也是氧化應激的標志物之一。兩者的體內水平可反映機體氧化應激的嚴重程度。本實驗研究結果表明阿里紅多糖可明顯減輕氧化應激損傷，呈劑量依賴性，提示阿里紅多糖可能通過抗氧化損傷作用減輕MIRI。caspase-3和Bcl-2是凋亡通路中的兩個重要的凋亡因子，參與細胞凋亡過程。caspase-3可促進細胞凋亡，而Bcl-2通過抑制cas‐pase-3激活、阻止細胞色素C釋放和降低細胞內鈣濃度，從而抑制細胞的凋亡。實驗結果顯示阿里紅多糖可顯著降低缺血心肌的凋亡，提示阿里紅多糖可能通過抗凋亡作用減輕MIRI。

綜上所述，阿里紅多糖對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有較好的保護作用，抗氧化、抗炎和抗凋亡可能是其重要的作用機制。