響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取黑豆皮總黃酮工藝

李娜 1，楊蕾 1，李菁 1，杜少兵 1，周慧慧 1，王小平 ，白吉慶

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽 712046；2.陜西省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務(wù)中心，陜西咸陽 712046）

黑豆在《神農(nóng)本草經(jīng)》中便以“生大豆”記載，具有益精明目、利水解毒的功效[1]。據(jù)文獻報道，黑豆皮含有大量的花青素[2-3]、黃酮醇類化合物[4-6]，具有抗氧化[7-8]、預(yù)防心血管疾病、降血糖、保護視力[9-10]等作用。目前，黑豆皮總黃酮的提取優(yōu)化工藝研究文獻報道較少。超聲波輔助提取技術(shù)能提高組分的溶出速度和效率，近年來在有效成分的提取工藝領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[11-12]；響應(yīng)面法通過設(shè)計合理的試驗方法，成為越來越多優(yōu)化提取工藝的方法之一[13-15]。本研究采用超聲波輔助提取工藝提取黑豆皮總黃酮，采用PlackettBurman優(yōu)選提取因素后，再通過響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，為黑豆皮的綜合利用提供一定的參考。

1 材料與儀器

新鮮黑豆經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶副教授鑒定為豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的種子，采于陜西省衡山縣，經(jīng)人工剝皮，干燥；蘆丁對照品（10080-200707）購買于中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、NaNO?、Al（NO3）3、NaOH均為分析純。

UV-6100 DOUBLE BEAM紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；XSE105DualRange電子分析天平（瑞士賽多利斯集團；0.01 mg；0.1 mg）；LG-01高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；KQ-300VDE超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

總黃酮測定參照文獻[16-18]方法，取蘆丁對照品，精密稱定，加乙醇使溶解，定容25 mL，搖勻，制得0.185 6 mg/mL的蘆丁對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL搖勻放置6 min；加入10%Al（NO3）3試液0.3 mL搖勻放置6 min；再加入4%NaOH溶液4 mL，并加入乙醇至刻度線，搖勻，放置15 min。用相應(yīng)試劑作空白，在500 nm處測定吸光度，以濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得線性方程Y=10.323X?0.003 8（r=0.999 6），表明蘆丁的質(zhì)量濃度在0.018 56～0.074 24 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的黑豆皮粉末（過60目篩），置于50 mL帶塞玻璃瓶中，用移液管按照不同液料比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，稱定質(zhì)量，超聲提取后取出靜置，補足減失的質(zhì)量，過濾，濾液放置備用。

2.3 總黃酮提取量的測定

精密吸取樣品溶液0.5 mL置10 mL容量瓶，按“2.1”項的顯色方法測定吸光度，根據(jù)以下公式計算黑豆皮總黃酮提取量：

式中：Y為吸光度，V為供試液體積（mL），W為樣品質(zhì)量（g）。

2.4 單因素試驗設(shè)計

取黑豆皮粉末（過60目篩）0.2 g，精密稱定，采用超聲提取法，按照表1的因素水平進行單因素試驗，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、超聲功率（因素B）、液料比（因素C）、超聲提取時間（因素D）、超聲溫度（因素E）對黑豆皮總黃酮提取量的影響。

表1 單因素試驗水平表Table 1 Factors and levels

2.5 Plackett Burman試驗設(shè)計

取黑豆皮粉末（過60目篩）0.2 g，精密稱定，采用超聲提取法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行Plack‐ettBurman試驗設(shè)計，按照表2的因素水平組合進行試驗，選擇對黑豆皮總黃酮有顯著性影響的因素。

表2 Plackett Burman試驗設(shè)計因素及水平Table 2 Plackett Burman Experimental design factors and levels

2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

取黑豆皮粉末（過60目篩）0.2 g，精密稱定，采用超聲提取法，依據(jù)Plackett Burman試驗結(jié)果，選取有顯著性影響的因素再進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，因素水平見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表Table 3 Response surface design factor level table

2.7 工藝驗證

取黑豆皮粉末（過60目篩）0.2 g，精密稱定，加66倍量體積分?jǐn)?shù)為67%的乙醇，超聲處理（功率270 W），濾液按照“2.1”項方法測定總黃酮。

2.8 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 10.0.7 統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)采用x±s的形式表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1可見，總黃酮提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，在65%處達到最大值，因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%；液料比在50∶1時，總黃酮提取量達到最大值；超聲功率變化幅度不大，在240 W處有最高值，選擇超聲功率為240 W；超聲溫度到達30℃后趨于平緩，在50℃略高，因此超聲溫度選擇50℃；超聲時間在20 min時，提取量達到最高值，30 min后反而降低，故超聲時間選擇20 min。

圖1 各因素對黑豆皮總黃酮提取量的影響Figure 1 Effects of various factors on the extraction amount of total flavonoids from Glycine max coat

3.2 Plackett Burman試驗結(jié)果

結(jié)果見表4、表5。

表4 Plackett Burman設(shè)計試驗結(jié)果Table 4 Results of Plackett Burman Experimental design

由表5可見，回歸方差模型具有顯著性（P<0.05），對黑豆皮總黃酮提取的影響有統(tǒng)計學(xué)意義的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和液料比（P<0.05）。

表5 Plackett Burman回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett Burman Regression model

3.3 響應(yīng)面法試驗結(jié)果

響應(yīng)面的試驗結(jié)果見表6，方差分析見表7。對表6的數(shù)據(jù)進行二次響應(yīng)面回歸擬合分析，得到編碼回歸方程為Y=62.21+4.18A+2.68B+10.01C?2.75AB+0.83AC+0.89BC?2.97A2+4.88B2?8.51C2。

表6 響應(yīng)面設(shè)計試驗結(jié)果Table 6 Results of Response surface design

由表7可見：模型極顯著（P=0.008 1<0.01），失擬項不顯著（P=0.685 4>0.05），說明模型合理；因素A乙醇體積分?jǐn)?shù)（P=0.041 5<0.05）影響顯著，因素C液料比（P=0.000 6<0.01）影響極顯著，影響顯著性順序為C>A>B，二次項C2（P=0.007 9<0.01）影響極顯著。

3.4 響應(yīng)面交互作用分析

等高線的形狀反應(yīng)因素間的交互作用，等高線為橢圓形表明兩者的交互作用顯著[20，24]。依次固定乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、液料比形成響應(yīng)面圖。等高線圖呈橢圓形，3D圖陡峭，表明交互作用越顯著。從圖2可以看出，在液料比方向的響應(yīng)面曲線明顯比乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率方向的曲線陡峭，說明液料比因素對響應(yīng)值總黃酮提取量影響更加顯著，這與表7結(jié)果一致。經(jīng)Design-Expert 10.0.7 軟件計算得到黑豆皮中總黃酮提取量的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)66.6%，超聲功率270 W，液料比66.4∶1（mL∶g），預(yù)測值總黃酮提取量為73.59 mg/g。根據(jù)實際操作情況，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、液料比依次為67%、270 W、66∶1（mL∶g）。

圖2 各因素交互作用對黑豆皮總黃酮提取量影響的曲面圖與等高線圖Figure 2 Surface profiles and contour maps of interaction of each factor affecting extraction amount of total flavonoids from Glycine max coat

表7 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface design

3.5 驗證試驗

3批黑豆皮總黃酮提取量的平均值為（73.50±0.18）mg/g（n=3）與預(yù)測值（73.59 mg/g）非常接近，表明該模型合適有效。

4 討論

本研究采用超聲輔助提取黑豆皮總黃酮，相比回流提取更加方便簡單，操作安全，適合于黑豆皮總黃酮的提取。同時，響應(yīng)面法設(shè)計合理的試驗，大大縮減了試驗次數(shù)和時間，并通過回歸方程尋求了最佳工藝參數(shù)，優(yōu)化得到總黃酮提取量最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)67%，超聲功率270 W，液料比66∶1，在此條件下，黑豆皮總黃酮提取量達到73.50 mg/g。

考察影響因素的試驗過程中，Plackett Burman試驗結(jié)果顯示超聲溫度對總黃酮的含量影響不顯著，原因可能與超聲過程中儀器自身發(fā)熱導(dǎo)致溫度不恒定有關(guān)，同時本實驗的黑豆皮經(jīng)過人工剝?nèi)。想y以獲得，取樣量較少，但相對之前黑豆皮總黃酮成分的提取工藝優(yōu)化來講，比溶劑提取法更簡單有效，所含雜質(zhì)更少，總黃酮的提取量提高了7～9倍。通過響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計，表明模型合理，具有良好的重復(fù)性。本文對黑豆皮的研究，能更有效地提高藥食兩用黑豆的資源利用效率，為黑豆皮的開發(fā)與應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)。