用于牛肉摻雜肉成分檢測的熒光PCR方法研究

本文采用熒光PCR法對牛肉摻雜肉成分進行檢驗，以不同比例混合的牛肉、豬肉與鴨肉為樣品，分別采集樣品DNA，根據不同源性設定特異性引物和探針。根據實驗結果可知，該方法可有效檢測出同等質量下三種肉質的DNA濃度差異、質量百分比，且誤差不超過5%，通過該檢測方式的應用，可對牛肉中摻雜肉成分進行準確有效檢測。

材料與方法

試劑與設備本實驗主要試劑為動物基因DNA提取試劑盒、Tap DNA聚合酶、分析純、引物和探針合成、人工全基因合成、無水乙醇。儀器為熒光PCR儀、高速冷凍離心機、絞肉機、電泳系統、恒溫混勻儀、電子天平。

實驗方法

（1）樣本制備。本實驗采用牛肉、豬肉和鴨肉，按照不同比例制備樣品；

（2）DNA提取。選擇50g動物肌肉樣本，用絞肉機攪碎后，先將樣本選取特定量放入2ml離心管內，將3.8μL蛋白酶K溶液放入混均儀中，溫度設定66℃，時間為60min，間隔15min取出顛倒混勻后取出；提煉樣本中的上清液，將其提煉出后沉淀晾干，加入49μL超純水使其完全溶解，放入-18℃冰箱內存儲備用。

（3）熒光PCR檢測。PCR反應體系為35μL，循環參數設置為95℃，變性4min，再運行35個循環，每個循環94℃，變性30s；將各樣本熒光PCR檢測設定為平行樣本，擴增Ct值選出兩個樣品的Ct值取均值；引物和探針階段，為檢測樣本內牛肉、豬肉的質量百分比，以牛源性、豬源性、鴨源性基因為靶基因，設置特異性引物與探針[1]。

實驗結果

特異為檢驗該實驗中設計引物的特異性，以豬、鴨、牛的DNA為模板，利用引物和探針擴增樣本。根據實驗結果可知，牛源性基因特異性引物和探針與其他物種的DNA沒有反應，僅與牛DNA產生擴散曲線；豬源性基因特異性與其他DNA無反應，僅與豬DNA產生擴散曲線；鴨源性基因特異性與其他DNA無反應，僅與鴨DNA產生擴散曲線。由此可見，該實驗中引物與探針擁有良好的特異性。

不同樣品DNA濃度差異采用PCR技術進行樣本檢測，對多種動物源性質量比值進行分析，得出相同質量下豬肉、鴨肉與牛肉中DNA濃度差值。選取0.02g的牛肉、鴨肉與豬肉、0.04g的牛肉、鴨肉和豬肉進行測試，并采用以下公式對不同肉樣品質量與樣品DNA質量比值進行計算。

式中，d為不同樣品質量與DNA質量比值。根據實驗結果可知，在質量為0.02g情況下，牛d為926.5，豬d為158，鴨d為42.7。在質量為0.04g情況下，牛d為925.7，豬d為583.5，鴨d為185.6。在質量存在差異時，d值可能因操作與儀器等原因產生一定誤差，取兩次實驗均值，即牛d為932.42，豬d為156.24，鴨d為11.53。

質量百分比采用熒光PCR檢測五個樣本中不同動物源性成分質量比值含量，分別從樣本中選取0.04g樣品進行PCR檢測，獲得質量百分比結果如下。樣品一：牛肉質量0.36，豬肉0.004，實際檢測質量比值為87.9%與12.1%；樣品二：牛肉質量0.028，鴨肉0.012，實際檢測質量比值為68.2%與31.8%；樣品三：牛肉質量0.026，豬肉0.014，實際檢測質量比值為63.5%與36.5%；可見，采用PCR檢測法可準確測出全部樣本中摻入的豬肉與鴨肉，且比值誤差不超過5%，與摻雜肉成分檢測需求相符合。

綜上所述，本實驗采用熒光PCR技術對牛肉中摻雜肉成分進行檢測。根據實驗結果可有效判斷不同源性成分的質量比含量、DNA濃度差異等，有效改善市面上假肉情況，取得理想的牛源性成分檢測成果。