谷胱甘肽硫轉移酶mu1基因啟動子區異常甲基化與卵巢子宮內膜異位癥的關系研究

王禮賢，李琰，康山

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMT）是一種常見的婦科疾病，育齡期女性中10%～15%患有此病，且其發病率呈逐年上升趨勢［1］。盡管多種學說和理論闡述了EMT的病因，但其確切機制仍不明確。近年來，許多證據表明與正常內膜相比，EMT患者的在位內膜和異位內膜中存在許多差異甲基化基因，例如：HOXA10、E-鈣黏蛋白和白介素12b等，可能在EMT的發展中發揮著重要作用［2-4］。

筆者在前期研究中采用高通量DNA甲基化芯片（Illumina Human Methylation 450K BeadChips）技術分析卵巢EMT患者的在位、異位內膜和對照女性子宮內膜的全基因組甲基化水平，篩選出包含谷胱甘肽硫轉移酶mu1（GSTM1）基因在內的多個差異甲基化基因［5］。GSTM1是一種重要的Ⅱ相代謝酶，具有較強的解毒作用；此外，其mRNA高表達可負向調節絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號通路，具有抑制細胞凋亡的作用［6］。本研究試圖分析卵巢EMT患者的在位內膜和異位內膜以及對照女性的子宮內膜中GSTM1基因啟動子區的甲基化水平、mRNA表達水平以及二者的相關性，以探討其異常甲基化與卵巢EMT發生和發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年9月—2015年12月于河北醫科大學第四醫院婦科行腹腔鏡手術治療并經病理檢查證實為卵巢EMT的患者65例（病例組），年齡26～45歲，平均年齡（35.7±6.4）歲，取其在位內膜及異位內膜（巧囊壁）；另選取同期在該院因宮頸上皮內瘤變（CIN）Ⅲ級行全子宮切除術的患者53例（對照組），年齡28～51歲，平均年齡（37.6±7.6）歲，取其子宮內膜為對照內膜，術后經病理檢查證實為正常的內膜組織。所有入選者既往月經規律，近3個月內未接受過激素治療，所取內膜組織為分泌期內膜，且排除子宮內膜單純性或復雜性增生、息肉等子宮內膜病變。本研究經河北醫科大學第四醫院倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2 標本采集 術中無菌采集卵巢EMT患者的在位內膜和異位內膜以及對照婦女的子宮內膜，放入RNAlater溶液（Carlsbad，美國）中，-20 ℃保存。

1.3 DNA提取和焦磷酸測序技術 采用DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取在位內膜、異位內膜和對照內膜中DNA，并采用NanoDrop 1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）檢測提取DNA的濃度。按要求分裝DNA，送至北京昂立信生物科技有限公司進行焦磷酸測序。PCR引物由PyroMark Assay Design 2.0設計及合成，在GSTM1基因啟動子區選擇兩個片段，片段一包含-116、-111、-104、-98 CpG位點；片段二包含-40、-23、-16 CpG位點，詳見圖1和表1。具體反應體系及反應條件參照焦磷酸測序PCR說明書逐步完成。

表1 焦磷酸測序的引物序列Table 1 Primer sequences used for pyrosequencing

圖1 GSTM1基因啟動子區中的片段一和片段二Figure 1 The first and second fragments in the GSTM1 promoter region

1.4 RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR） 采用Trizol試劑盒（Invitrogen，美國）提取在位內膜、異位內膜和對照內膜中RNA。cDNA合成采用PCR反轉錄試劑盒（Thermo，美國）。具體反應體系及反應條件參照RT-qPCR說明書。引物序列詳見表2。

表2 RT-qPCR的引物序列Table 2 Primer sequences used for RT-qPCR

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用成組t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象一般資料比較 對照組和病例組年齡、初潮年齡、月經周期、胎產次比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 對照組與病例組一般資料比較（±s）Table 3 Comparison of the general information of the case group and control group

表3 對照組與病例組一般資料比較（±s）Table 3 Comparison of the general information of the case group and control group

胎產次（次）對照組 53 37.6±7.6 13.1±1.4 29.0±2.2 1.1±0.6病例組 65 35.7±6.4 12.8±1.5 28.6±2.4 1.2±0.6 t值 -1.474 -1.021 -0.935 0.901 P值 0.143 0.309 0.352 0.370組別 例數 年齡（歲）初潮年齡（歲）月經周期（d）

2.2 三組內膜GSTM1基因啟動子區片段一平均甲基化水平比較

2.2.1 三組內膜GSTM1基因啟動子區片段一（-116、-111、-104、-98 CpG位點）平均甲基化水平比較對照內膜、在位內膜和異位內膜片段一平均甲基化水平分別為8.90（5.61，13.07）、6.91（3.75，11.04）、4.21（2.96，6.01）。三組內膜片段一平均甲基化水平比較，差異有統計學意義（H=39.325，P＜0.001）；其中在位內膜和異位內膜片段一平均甲基化水平低于對照內膜（H=2.588，P=0.046；H=6.496，P＜0.001），異位內膜片段一平均甲基化水平低于在位內膜（H=4.213，P＜0.001），見圖2A。

2.2.2 三組內膜GSTM1基因啟動子區片段二（-40、-23、-16 CpG位點）平均甲基化水平比較 對照內膜、在位內膜和異位內膜片段二（-40、-23、-16 CpG位點）平均甲基化水平分別為11.69（8.21，15.09）、11.38（7.75，14.36）、8.21（4.15，13.42）。三組內膜片段二平均甲基化水平比較，差異有統計學意義（H=11.233，P=0.004）；其中異位內膜片段二平均甲基化水平低于在位內膜和對照內膜（H=7.693，P＜0.001；H=8.257，P＜0.001），在位內膜與對照內膜片段二平均甲基化水平比較，差異無統計學意義（H=0.682，P=0.504），見圖2B。

2.3 三組內膜GSTM1 mRNA表達水平比較 對照內膜、在位內膜和異位內膜mRNA表達水平分別為0.002（0.001，0.006）、0.006（0.002，0.020）、0.047（0.015，0.389）。三組內膜mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（H=48.965，P＜0.001）；其中在位內膜和異位內膜mRNA表達水平高于對照內膜（H=6.994，P=0.011；H=3.414，P＜0.001），異位內膜mRNA表達水平高于在位內膜（H=3.846，P＜0.001），見圖2C。

圖2 三組內膜GSTM1基因啟動子區片段一、二平均甲基化水平和mRNA表達水平比較Figure 2 The average methylation level in the first and second fragment and the mRNA expression level in GSTM1 promoter region in eutopic and ectopic endometriotic tissues in case group and that in endometrial tissues in control group

2.4 GSTM1 基因啟動子區甲基化水平與其mRNA表達水平的相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示：GSTM1 mRNA表達水平與其啟動子區片段一（-116、-111、-104、-98 CpG位點）、片段二（-40、-23、-16 CpG位點）平均甲基化水平均呈負相關（rs=-0.61，P＜0.001；rs=-0.52，P＜0.001）。

近年來，許多研究表明EMT是一種表觀遺傳性疾病，而與正常子宮內膜相比，EMT患者的在位內膜和異位內膜的甲基化表達譜中存在顯著差異［7-8］。筆者前期研究采用Illumina Human Methylation 450K BeadChips技術分析卵巢EMT患者的在位、異位內膜和對照女性子宮內膜的全基因組甲基化水平，發現與對照內膜相比，卵巢EMT患者的在位內膜和異位內膜GSTM1基因啟動子區呈現低甲基化水平。為了驗證該芯片技術分析結果，本研究通過擴大樣本量分析了三組內膜GSTM1基因啟動子區甲基化水平、mRNA表達水平以及二者的關系，發現與對照內膜相比，卵巢EMT患者的在位內膜和異位內膜GSTM1基因啟動子區低甲基化和mRNA高表達，并且二者之間呈負相關。在此結果的基礎上，筆者通過

3 討論

生信分析發現：GSTM1基因的轉錄因子AP-2α在啟動子區的結合區域是（GGCCGAGGGGCG），此區域恰好覆蓋片段一中的-111和-104兩個CpG位點，由此推測-111和-104兩個CpG位點可能是AP-2α的轉錄結合位點。通過上述結果可以推測GSTM1基因通過啟動子區域的異常低甲基化使其mRNA表達升高，可能在卵巢EMT的發生和發展中起作用。

GSTM1是一種Ⅱ相解毒酶，可以催化包括還原型谷胱甘肽、毒物和致癌物在內的許多親電子化合物之間的反應，具有較強的解毒作用［9］。迄今為止，許多學者認為GSTM1基因的多態性與EMT的發生有關，并認為GSTM1 null基因型導致解毒酶活性的缺失，從而增加EMT的易感性［10-11］。然而，上述研究對象是血液標本，而本研究選取的是組織標本。本研究結果顯示，與對照內膜相比，卵巢EMT患者的在位內膜和異位內膜GSTM1 mRNA高表達。GSTM1除了經典的解毒酶活性之外，還可與一些大分子相互作用，參與細胞增殖和凋亡的調節。KALININA等［12］和DORION等［6］認為GSTM1是凋亡信號激酶1（ASK1）的內源性抑制劑，GSTM1 mRNA高表達可與ASK1結合產生蛋白質復合物，抑制ASK1的活性，能夠維持下游靶分子p38的基礎磷酸化水平，從而抑制p38MAPK信號通路的傳導。HAN等［13］在小鼠EMT模型中證明抑制ASK1活性可顯著抑制子宮內膜細胞凋亡。HUI等［14］在大腸癌細胞株中發現p38MAPK信號通路的部分負調節因子過表達，其中包括GSTM1。此外，RYOO等［15］認為GSTM1 mRNA高表達還可以抑制絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶激酶1（MEKK1）的活性，從而抑制JNK/SAPK信號通路的促凋亡作用。p38MAPK和JNK/SAPK均是MAPK信號傳導通路中的主要通路，而此通路貫穿于EMT整個發生和發展過程，在內膜細胞的凋亡、侵襲和血管生長等方面發揮著重要作用［16］。筆者未來會進一步研究GSTM1 mRNA高表達能否通過抑制MAPK信號傳導通路達到抑制子宮內膜細胞凋亡的作用。

本研究提示卵巢EMT患者的在位內膜和異位內膜GSTM1基因啟動子區異常低甲基化所致mRNA高表達可能在卵巢EMT的發生和發展中起重要作用，這不僅為其發病機制的研究提供了重要的理論依據，還可能為臨床治療提供新思路。

作者貢獻：李琰、康山進行文章的構思與設計；王禮賢、李琰、康山進行研究的實施與可行性分析，論文的修訂；王禮賢、李琰進行數據收集及整理，統計學處理，結果的分析與解釋，撰寫論文；康山負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。