高致病性禽流感檢測方法的分析比對

文│張亦弛 呂艷秋 高曉波（北京市昌平區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心）

高致病性禽流感是一種能引起禽類短時間內(nèi)大量死亡的人畜共患病，是國家規(guī)定的一類動物疫病，它的流行對養(yǎng)殖業(yè)造成非常大的傷害。高致病性禽流感病毒為單股負(fù)鏈RNA，依據(jù)其外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白，可分為H5亞型和H7亞型，其中H7N9和H5N1為目前我國常見的亞型。能夠快速準(zhǔn)確且便宜地診斷出高致病性禽流感是目前我國基層獸醫(yī)檢測部門的工作重點之一。本實驗主要選用了目前商品化的禽流感檢測方法進(jìn)行了診斷方面的比較，為臨床工作中能夠高效檢測禽流感病毒提供參考。

一、試驗樣品及采集方法

2018年，北京市昌平區(qū)某雞場送檢30只雞的30份血清樣品和對應(yīng)的60份咽肛拭子樣品。血清樣品為采集翅靜脈血后25℃溫箱3小時靜置后自然分離，用于血凝抑制（HI）試驗；咽肛拭子一份為用棉簽分別擦拭咽壁和泄殖腔壁分泌物后立刻放入干凈的空試管，用于膠體金試紙條試驗；另一份為咽肛拭子采集分泌物后立刻放入含有3%甘油的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）的試管中低溫保存，用于實時熒光定量PCR試驗。

二、主要試劑和試驗方法

1.血凝抑制（HI）試驗。H7N9，H5N1-R7株，H5N1-R8株禽流感（AI）抗原及陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。試驗方法和判斷依據(jù)按照GB/T18936-2020《高致病性禽流感診斷技術(shù)》進(jìn)行：以完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)為HI滴度，HI≤3log2為陰性，HI≥5log2為陽性，HI=4log2為可疑，復(fù)檢后HI≥4log2為陽性。

表1 禽流感病毒抗體血凝抑制試驗結(jié)果

2.膠體金試紙條試驗。禽流感病毒（AIV）通用型、H7亞型和H5亞型抗體檢測試紙條由韓國某公司生產(chǎn)。試驗方法和判斷依據(jù)按照說明書進(jìn)行：將咽肛拭子插入稀釋液中攪拌擠壓，使分泌物充分溶解，然后加3～5滴溶液到進(jìn)樣孔（充分浸濕即可），等待5分鐘后，當(dāng)質(zhì)控線C和檢測線T同時出現(xiàn)紅線時為陽性，只出現(xiàn)質(zhì)控線C呈紅線為陰性，只出現(xiàn)檢測線T為紅線則試驗無效。此外，10分鐘后的觀察結(jié)果同樣視為無效。

3.實時熒光定量PCR試驗（Real-time PCR）。禽流感病毒通用型、H7亞型和H5亞型實時熒光定量PCR試劑盒和核酸提取試劑盒由上海之江生物科技股份有限公司生產(chǎn)，試驗方法和判斷依據(jù)按照試劑盒說明書進(jìn)行。

◎圖1 膠體金試紙條檢測結(jié)果

三、試驗結(jié)果

1.血凝抑制（HI）試驗。3個禽流感病毒抗體的陽性率為均≥90%。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。

2.膠體金試紙條試驗。H7亞型和H5亞型均為陰性。AIV通用型有4個呈現(xiàn)弱陽性，復(fù)檢后3個變?yōu)殛幮裕?個依然為弱陽性，見圖1。

3.實時熒光定量PCR試驗（Real-timePCR）。禽流感通用型、H7亞型和H5亞型均為陰性。

四、結(jié)果分析

1.HI抗體合格率在90%以上，說明現(xiàn)有H7亞型和H5亞型疫苗的免疫接種對雞群有很好的保護作用，這種情況下出現(xiàn)禽流感病毒感染的概率非常低。

2.膠體金試紙條中初次檢測有4個弱陽性，復(fù)檢后有3個樣品的復(fù)檢結(jié)果和原檢測結(jié)果不一致，說明膠體金試紙條檢測方法有假陽性的可能。膠體金試紙條的制作原理和方法，決定了影響其敏感度的因素有很多，比如抗體特異性、包被量、膜材料、膠體金顆粒、緩沖體系等等，這些都會對最終的結(jié)果判斷產(chǎn)生影響。

3.H7亞型和H5亞型的抗原檢測結(jié)果中，膠體金試紙條和實時熒光定量PCR均為陰性，表明此30只雞均無H5亞型和H7亞型的感染。對于禽流感通用型抗原檢測，膠體金試紙條復(fù)檢后依然有弱陽性，而實時熒光定量PCR為陰性。這可能是由于PCR的檢測準(zhǔn)確度和靈敏度均高于膠體金試紙條檢測，可合理懷疑是膠體金試紙條檢測的結(jié)果產(chǎn)生了假陽性，故最終的檢測結(jié)果以PCR為準(zhǔn)，為陰性。

五、結(jié)論

膠體金試紙條檢測法快捷方便，時間短（5～10分鐘），對儀器和環(huán)境要求低（無儀器，室溫即可），但是有假陽性的風(fēng)險，適合做前期篩查；實時熒光定量PCR方法準(zhǔn)確性高，但是耗時長、對儀器和環(huán)境要求也高，而且試劑盒費用昂貴，適合篩查出疑似陽性樣品后做進(jìn)一步的鑒定。這樣的安排更適合縣/區(qū)級的動物疫控單位進(jìn)行本轄區(qū)的禽流感檢測。

另外，從禽流感通用型、H7亞型、H5亞型的抗原陽性和抗體保護率在90%以上可看出，疫苗免疫接種是保護雞群不受高致病性禽流感感染的可靠方法，同時也可以輔助判斷是否出現(xiàn)禽流感感染。