油松花粉離體萌發培養基及花粉貯藏條件研究

于慶福

(喀左縣林業種苗技術服務中心，遼寧 喀左 122300)

油松Pinustabulaeformis為松科松屬常綠喬木，我國特有樹種。針葉深綠色，2針1束，雌雄同株，花期為每年的4-5月，球果翌年10月成熟。油松為喜光、深根性樹種，喜干冷氣候，在土層深厚、排水良好的酸性、中性或鈣質黃土上均能生長良好[1]。油松為我國北方地區重要的用材樹種之一，也是水土保持和城鄉綠化的重要樹種，具有重要的經濟和生態價值。

在開展油松雜交育種和油松種子園控制授粉等工作中，常進行花粉貯藏和生活力測定，這樣可避免無活力花粉的使用，否則將導致雜交計劃的失敗[2-3]。因此一種有效的花粉生活力檢測方法及花粉貯藏條件的探索，對確保油松雜交和控制授粉的成功具有重要意義。本研究采用正交試驗設計，篩選適合油松花粉萌發的離體培養基，并對不同貯藏溫度及時間的油松花粉生活力進行檢測與評價，為油松人工授粉和雜交育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

油松雄花序于2019年5月6日采自沈陽農業大學植物園。

1.2 方 法

1.2.1 花粉采集

采集發育正常即將散粉的油松雄花序，裝入袋內，帶回實驗室。將采集回來的雄花序平鋪在硫酸紙上，放置24 h，待其散粉后，用鑷子夾住花序輕輕將花粉抖落，篩除雜質后備用。

1.2.2 花粉貯藏

將花粉分別裝入1.5 mL離心管中，做好標記，然后將裝有花粉的離心管分別在常溫(25 ℃)、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃條件下各貯藏10管。

1.2.3 花粉萌發離體培養基的篩選

以采集的油松新鮮花粉為試材，采用L9(34)正交表進行培養基篩選，因素和水平見表1，研究蔗糖、硼酸和pH值3個因素不同水平對油松花粉離體萌發的影響。培養基均添加瓊脂8 g·L-1，培養基制好后倒在直徑100 mm培養皿中，培養基厚度3 mm，待自然冷卻至室溫后，將花粉均勻地撒在培養基上，蓋上蓋，置于(25±1)℃ 培養室中培養72 h后，在光學顯微鏡下觀察花粉的萌發情況。觀察顯示：培養24 h的油松花粉無明顯萌發跡象；培養48 h的油松花粉雖已萌發，但不適于觀察和統計萌發率；培養72 h的油松花粉完全萌發，便于觀察和統計萌發率。以花粉管的長度超過花粉粒直徑的1.5倍為花粉萌發標準，每個培養皿取3個視野，統計其平均萌發率，重復4次。通過極差分析和方差分析篩選適宜油松花粉萌發的培養基。

表1 正交試驗因素和水平

1.2.4 不同貯藏條件對花粉生活力的影響

采用優化的培養基測定油松初始萌發率后，將油松花粉分別放在-80 ℃、-20 ℃、4 ℃和25 ℃ 條件下貯藏，待花粉在4種溫度條件下貯藏15 d、30 d后，各取出1管，在優化的培養基上進行培養，72 h后統計萌發率。

1.3 數據處理

應用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析，S-N-K法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 花粉萌發離體培養基的篩選

由表2可知，蔗糖的R值最大，pH值的R值最小，說明此試驗設計下蔗糖不同質量濃度對油松花粉萌發的影響最大，其次是硼酸，影響最小的是pH值；從平均值來看，蔗糖質量濃度的第1水平最好，硼酸質量濃度的第2水平最好，pH值的第2水平最好，說明最佳培養基是蔗糖100 g·L-1+硼酸0.10 g·L-1，pH值6.5。

表2 油松花粉離體萌發培養基篩選的極差分析

由表3可知，在該試驗條件下，蔗糖和硼酸兩個因素不同水平對油松花粉萌發的影響均達到極顯著水平，pH值不同水平對油松花粉萌發的影響不顯著。

表3 油松花粉離體萌發培養基篩選的方差分析

由表4可知，蔗糖100 g·L-1對油松花粉萌發的效果最好，150 g·L-1的效果次之，200 g·L-1的效果最差，且三者間差異均達到了極顯著水平；硼酸0.1 g·L-1的效果最好，0.2 g·L-1的效果次之，0.05 g·L-1的效果最差，0.1 g·L-1和0.05 g·L-1花粉萌發率的差異達到極顯著水平；但0.1 g·L-1與0.20 g·L-1、0.20 g·L-1與0.05 g·L-1對花粉萌發率的影響均未達到極顯著水平；不同pH值對油松花粉萌發的影響未達到顯著水平。

表4 油松花粉離體萌發培養基篩選的多重比較

根據極差分析、方差分析和多重比較結果，篩選出油松花粉萌發的離體培養基為蔗糖100 g·L-1+硼酸0.10 g·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值6.5，該培養基位于設計的第二個組合，測定油松新鮮花粉萌發率為93.12%，即花粉貯藏前的初始萌發率為93.12%。

2.2 不同貯藏條件對花粉生活力的影響

由表5可知，-80 ℃條件下油松花粉貯藏15 d和30 d后萌發率分別為92.93%和91.27%，兩者與新鮮花粉的萌發率差異不顯著；-20 ℃條件下花粉貯藏15 d和30 d的萌發率分別為92.24%和88.65%，其中貯藏30 d后的萌發率與新鮮花粉的萌發率差異達到極顯著水平；4 ℃條件下花粉貯藏15 d和30 d后的萌發率分別為90.69%和86.84%，貯藏30 d后的萌發率與新鮮花粉的萌發率差異達到極顯著水平；25 ℃條件下貯藏15 d和30 d的萌發率分別為90.27%和82.66%，與新鮮花粉萌發率差異均達到極顯著水平。

表5 4種貯藏溫度下花粉萌發率的多重比較 %

3 討論與結論

沈靜華等研究蔗糖質量濃度和硼酸質量濃度對油松花粉生活力的影響時，得出在蔗糖10%+硼酸0.01%的固體培養基上，油松新鮮花粉萌發率可達98.6%[4]。本研究首次采用正交試驗設計，通過統計分析得出適宜油松花粉萌發的離體培養基為蔗糖100 g·L-1+硼酸0.10 g·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值6.5，新鮮花粉的萌發率為93.12%，篩選的固體培養基在蔗糖質量濃度和硼酸質量濃度上與沈靜華等的結論一致；同時本試驗中蔗糖為油松花粉萌發的最主要影響因子，蔗糖質量濃度為100 g·L-1的油松花粉萌發率最高，與周強等研究樟子松花粉適宜萌發培養基中的蔗糖質量濃度也一致[5]。

不同溫度貯藏的油松花粉，隨貯藏時間延長，生活力降低；貯藏溫度越低，花粉生活力下降得越緩慢，貯藏溫度越高，花粉生活力下降就越快。這是因為花粉貯藏過程中保持較低溫度，能夠使花粉代謝受到抑制，酶活性減弱，呼吸作用降低，從而能夠使花粉長時間地維持生活力，這一結論與吳月亮等[6]、張慧會等[7]、Wang等[8]對花粉生活力與貯藏性的研究結論一致。

本項研究中油松花粉在4種溫度下貯藏30 d，均能保持較高生活力，對開展油松授粉解決花期不遇和異地運輸等時空問題具有重要的實際意義。