馴鹿精子顯微與超微結構研究

邢海華，劉偉石，左 月，鄭 義，李和平

（東北林業大學 野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040）

精子屬于生殖細胞，由雄性動物產生并能將遺傳物質穩定地傳遞給子代，當動物精子的生理結構與功能出現異常時，會影響雄性動物的繁殖能力，甚至會影響子代的健康狀況。因此，對精子的形態特征以及超微結構進行細致的研究，能夠進一步檢驗不同處理方法對精子結構的影響，還能為精子的體外受精、頂體反應發生時精子結構的改變情況提供基礎數據，即精子形態以及結構的研究能夠有助于受精規律的揭示與總結［1］。而對動物精子超微結構的研究經過了一個漫長的探究過程，最初有學者對人、狗的精子進行超微結構研究；隨著電鏡技術的不斷升級與改造，動物精子超微結構研究方式也產生了質的飛躍。國內對哺乳動物精子超微結構的探究相對較晚，曾陸續對綿羊［2］、驢［3］、豬［4－6］、兔［7］、大熊貓［8］、藍狐［9－10］、梅花鹿［11－12］等動物精子的超微結構展開了細致的研究，并詳盡分析了頂體囊泡化的特征以及各類動物精子的結構特異性。

關于鹿精子超微結構的研究也已有一些基礎，如馮懷亮等［11］通過電子顯微鏡對東北梅花鹿精子的超微結構進行細致觀察，結果表明，東北梅花鹿精子的超微結構與其他哺乳動物精子相差不大，最明顯特征是其精子頂體前端相對膨大，頭部偏長，有明顯的環狀結構將精子的中段與主段分開。楊智等［12］通過光學顯微鏡以及電子顯微鏡觀察了梅花鹿精子在冷凍前后超微結構的改變，結果表明，冷凍解凍后精子頂體部位發生膨脹，部分精子的頂體內容物外溢，頂體內部出現明顯空泡現象，部分線粒體丟失。之后，李和平等［13］對馬鹿精子的超微結構進行了觀察與研究，并成功測得馬鹿精子的全長以及頭、頸、尾長。史文清等［14］觀察并對比分析了冷凍保存方法對馬鹿精子超微結構的影響與作用。

馴鹿是我國使鹿部落鄂溫克少數民族的重要生產資料，僅分布于北緯50°～53°的我國內蒙古大興安嶺根河市，由二十幾個鄂溫克家庭飼養，數量約有1 000頭。關于我國馴鹿精子形態以及超微結構的研究尚未見報道。試驗對馴鹿精子形態結構及超微結構進行觀察，并對其結構的各部分進行觀測，掌握馴鹿精子的顯微與超微結構，以期為馴鹿精子精液冷凍保存、體外受精與頂體反應發生過程等研究提供基礎數據與技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馴鹿精液，于2020年9月采自根河林業局馴鹿養殖基地的3頭成年健康馴鹿，制成細管凍精，用38～40℃水浴解凍，解凍后精子活力在0.3以上，用0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS溶液，pH值7.2）沖洗2次，每次6 000 r／min離心2 min，除去上清液，將最后一次沉淀加入0.1 mol／L PBS溶液1 mL，以保持馴鹿精子活力及形態結構。

1.2 主要器械、儀器與化學試劑

TDL－5－A低速臺式大容量離心機，購自上海安亭科學儀器廠；OLYMPUS IMF－2相差顯微鏡，購自日本OLYMPUS株式會社；MOTIC SFC－18 SERIES油鏡，購自麥克奧迪實業集團公司；量制滬字02270113血細胞計數板，購自上海市求精生化試劑儀器有限公司。以上儀器由東北林業大學野生動物與自然保護地學院公共實驗室提供。

H－7650透射電子顯微鏡，購自日本日立公司；EM UC7超薄切片機，購自德國LEICA公司。以上儀器由東北農業大學分析測試共享中心提供。

PBS、戊二醛、吉姆薩染色液、四氧化鋨溶液、乙醇、丙酮、環氧樹脂812包埋劑、醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛，由東北農業大學分析測試共享中心提供。

1.3 顯微鏡檢

通過光學顯微鏡對馴鹿精子進行鏡檢觀察，研究其顯微結構特征。

1.3.1 染色 用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）沖洗3次，并將精子稀釋成1×104個／mL，涂抹在載玻片上，空氣干燥。用吉姆薩染色液滴在涂片上染色5 min，再用純化水沖洗，待干燥。

1.3.2 鏡檢 將樣品放置在顯微鏡下觀察結構特征。

將目微尺放入目鏡，測量精子長度，在不同放大倍數下用臺微尺校正測微尺。需要注意的是，如果調整顯微鏡的放大倍數，則需要重新用臺微尺校正測微尺。

在視野中任選45個精子，測量精子的全長以及頭部、頸部、尾部各部分長度，各部分測量不少于3次，取平均值，并記錄，之后用SPSS軟件進行統計分析。

1.4 精子超微結構研究

利用透射電子顯微鏡技術研究馴鹿精子超微結構。

1.4.1 前固定 將精子懸液用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）沖洗3次，每次10 000 r／min離心5 min，除去上清液；將最后一次沉淀加入2.5%戊二醛，預固定2 h，保持馴鹿精子形態結構。

1.4.2 沖洗 用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）沖洗3次，每次放入4℃冰箱中靜置15 min，10 000 r／min離心3 min，去除上清液。

1.4.3 后固定 在通風櫥內，滴加1%四氧化鋨溶液，4℃冰箱內固定2 h。

1.4.4 沖洗 用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）沖洗3次，每次放入4℃冰箱中靜置15 min，10 000 r／min離心3 min，去除上清液。

1.4.5 脫水 分別用50%、70%、90%乙醇進行梯度脫水，于4 ℃冰箱中靜置5 min；期間10 000 r／min離心3 min，去除上清液，用100%乙醇脫水2次，于4℃冰箱中靜置7 min，期間10 000 r／min離心3 min，去除上清液。

1.4.6 置換 用丙酮置換一次：無水乙醇、丙酮體積比為1∶1，各滴加0.5 mL，4℃冰箱靜置7 min，再10 000 r／min離心3 min，去除上清液；再滴加1 mL無水丙酮，室溫靜置5 min。

1.4.7 浸透與包埋 用環氧樹脂812進行浸透，純丙酮、環氧樹脂812包埋（體積比為1∶1），25℃靜置30 min；純丙酮、環氧樹脂812包埋（體積比為1∶2），25℃靜置90 min；再以純丙酮、環氧樹脂812包埋（體積比為1∶3），開蓋過夜。再用環氧樹脂812進行包埋。

1.4.8 聚合 在恒溫箱內60℃聚合3 d。

1.4.9 切片 用超薄切片機進行切片，厚度5～7μm，所有切好的切片用帶有支持膜的樣品載網撈起，切片放進培養皿。

1.4.10 染色 在25℃條件下，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行雙重染色，然后用純化水沖洗，待檢。

1.4.11 鏡檢、照相 用H－7650透射電子顯微鏡對處理好的樣品進行鏡檢，并照相記錄。

2 結果

顯微鏡下觀測，馴鹿精子全長（90.545±5.374）μm，由頭部、頸部、尾部構成，這三部分長度分別為（13.009±1.095）μm、（1.991±0.694）μm、（75.545±5.592）μm。

2.1 頭部

馴鹿精子頭部呈現略微扁平的卵圓形，頭長（13.009±1.095）μm，內部含有高度濃縮并且電子密度相對較高的精核，精核的矢狀面呈現長楔形。頂體是兩層膜結構，形似囊狀，包裹在精核外側，遠離精核的一側是頂體外膜，鄰近精核的一側是頂體內膜，兩層膜相對平行，且都是雙層膜結構，兩者在頂體尾部交相融合成為一個整體。頂體前端相對膨大且呈現對稱結構，其電子密度相對較低；頂體后端為頂體后區，電子密度更低，見圖1、圖2。

圖1 馴鹿精子超微結構（20 000×）

圖2 馴鹿精子頭部超微結構（20 000×）

2.2 頸部

馴鹿精子的頸部位于頭部與尾部之間，部位較短，并且不明顯，從近端中心粒到遠端中心粒這一部位為頸部，頸長為（1.991±0.694）μm。近端中心粒位于精核下面的淺窩中，呈現偏短的圓筒狀，與精子尾部的縱軸多呈垂直關系，矢狀面多呈圓形。有漏斗狀結構包裹在頸部的外側，漏斗狀結構由9條縱向緊密排布的粗纖維構成，上部附著于精核的下端，下部附著于精子尾部的中段。

2.3 尾部

馴鹿精子尾部位于頸部后側，尾長為（75.545±5.592）μm，可分為中段、主段、終段。中段的縱切面清晰可見，線粒體呈現念珠狀分布于軸絲的外側，構成線粒體鞘，見圖3、圖4；橫切面上，由9對微管結構形成同心環結構，中心部位有一對中央微管，形成“9＋2”結構，而外側還包裹著9束外致密纖維，共同組成“9＋9＋2”結構，再外層被線粒體鞘包被著，見圖5、圖6。中段的末端與主段的起始部位有一個明顯的環狀結構。主段是馴鹿精子尾部的主要部位，周圍包被著纖維鞘。纖維鞘的末端與細胞膜緊密貼合，構成一層薄膜包裹著微束管，在向后延伸過程中，末端直徑緩慢變小。尾部主段橫切面可見“9＋2”結構。終段是精子尾部的末端，結構相對簡單，只有“9＋2”結構以及最外層的細胞膜。

圖3 馴鹿精子尾部斜切面結構（25 000×）

圖4 馴鹿精子尾部縱切面結構（30 000×）

圖5 馴鹿精子尾部中段橫切面結構（40 000×）

圖6 馴鹿精子尾部橫切面結構（20 000×）

3 討論與結論

為了探究與揭示哺乳動物精子的形態構造與超微結構特征，一些學者陸續進行了各類哺乳動物精子的相關試驗研究，盡管各類哺乳動物正常精子的形態與結構存在著一定的差異，但是都具有部分相同的結構特點：精子總體能夠分成頭部、頸部以及尾部，而尾部又可細分為中段、主段以及終段。哺乳動物精子之間最主要的差別是頭部形態，如牛、豬、馬等動物精子頭部呈現略微扁平的卵圓形；而虎、人精子頭部則呈梨形。造成各類哺乳動物精子頭部出現顯著區別的原因是精核與頂體的形態結構存在差異。本試驗結果表明，馴鹿精子具備哺乳動物精子的主要特征，即含有頭部、頸部、尾部，且尾部能夠清晰地分為中段、主段、終段。

馴鹿精子全長（90.545±5.374）μm，頭部長（13.009±1.095）μm，頸部長（1.991±0.694）μm，尾部長（75.545±5.592）μm，其中尾部占精子全長的比例最大；而馬鹿精子全長（58.75±2.35）μm，頭部長（8.93±0.24）μm ，頸部長（1.00±0.16）μm，尾部長（48.18±1.18）μm［13］。馴鹿精子頭部、頸部、尾部的長度分別占精子全長的14.37%、2.20%、83.43%；馬鹿精子頭部、頸部、尾部的長度分別占精子全長的15.20%、1.70%、82.01%；馴鹿精子長度是馬鹿精子長度的1.54倍；精子形態上，馴鹿精子頭部相對偏小而尾長，馬鹿精子則頭相對偏大而尾較短；馴鹿精子與馬鹿精子在全長以及各部位長度、比例上的差異可能是種屬間的差異所造成的。

馴鹿精子的頂體前端相對平滑、膨大且呈現對稱結構。精子頸部位于頭部與尾部之間，部位較短，并且不明顯。精子尾部的中段與主段可見清晰的環狀結構，中段縱切面可見線粒體呈念珠狀，緊密分布于軸絲的兩側，構成線粒體鞘；而橫切面則能清晰觀察到軸絲具有“9＋9＋2”微管結構，這與馬鹿、梅花鹿精子的軸絲結構一致［11－14］，與其他哺乳動物如大熊貓［8］等的精子結構一致，與火雞［15］等鳥類精子的軸絲結構相似。通常認為，中央微管具有傳導的作用與功能，外圍的9對微管結構承擔收縮調節的功能。

4 致謝

試驗中樣品采集得到根河縣林業局楊建民，計劃科王慶海、田曉瑞，多種經營科吳曉宇、蓋廣輝等同志，以及都慧中老師的大力支持，在此表示感謝！