維生素E對小鼠精子質量的影響研究

韓 奕，張 林，侯令欣，張鴻露，景文娟，溫詔禹，張 杰，尉俊嶺，莫顯紅

（赤峰學院 化學與生命科學學院，內蒙古 赤峰 024000）

隨著社會經濟的迅猛發展，人們對生活品質的追求不斷提高。其中豬、牛、羊肉作為日常生活中肉類食品的主要來源，需求量不斷增加，同時對其品質的要求也在提高。目前在家畜育種繁殖過程中仍然存在很多問題，如家畜精子品質差、存活率低，導致受精率低，甚至出現不育的現象，這是目前亟待解決的問題［1－3］。精子從發生到成熟的過程中，如果受到周圍環境、生殖毒性以及機體內分泌調節紊亂等因素的影響，會引起精子質量下降、繁殖性能受損［4－5］；精漿中抗氧化酶活性不足是導致男性不育的主要原因［6－8］；此外，精液保存過程中產生的氧化應激現象，是導致精子損傷及受精能力下降的重要原因之一［9－10］。

維生素E是機體所必需的微量營養素，但它在體內不能自主合成，必須從相應的食物或營養強化劑中才能獲得。相關試驗結果證明，維生素E具有抗氧化活性，在生殖方面具有積極作用：它能夠提高家畜生殖器官發育、精子活率以及精子品質，降低精子畸形率，從而提高生育能力［2－3］；維生素E還可以防御輻射所致的氧化損傷，保護精細胞、卵細胞、肺部細胞、血紅細胞和白細胞膜的完整性［11－12］。

本試驗以昆明小白鼠為試驗動物，探討如何在體內對精子形成有效的保護。迄今為止，飼喂維生素E軟膠囊對小鼠精液品質的影響及適宜濃度范圍的研究較少。本試驗主要通過檢測精子活力、精子密度，綜合評價維生素E對精子特性的影響；并將各組精液與卵母細胞進行體外受精，通過統計卵裂率和囊胚率評價維生素E對精子體外受精能力的影響，綜合分析維生素E對改善小鼠精子品質和受精能力之間的相關性，以期為家畜動物育種生產提供參考。

1 材料

1.1 試驗動物

昆明白系3～4周齡雄性小鼠、7～8周齡成熟雌性小白鼠各36只，購自斯貝福生物技術有限公司。

1.2 主要試劑及操作液

試驗所用試劑除特別說明外，均為Sigma公司產品。

1）M2液的配制。稱取NaCl 2.767 g，KCl 0.178 g，KH2PO40.081 g，NaHCO30.168g，MgSO4（單溶）0.147 g，CaCl2（單溶）0.125 g，乳酸鈉1.660 mL，葡萄糖0.500 g，丙酮酸鈉0.011 g，谷氨酰胺0.073 g，青霉素G 0.030 g，加水混勻定容至500 mL，使用一次性無菌濾器過濾后放于冰箱4℃儲存。使用前取適量液體加入3 mg／mL牛血清白蛋白（BSA），現用現配。

2）精子獲能液和受精液。人類輸卵管液（HTF液，M1130，購自南京愛貝生物科技有限公司），專為受精過程中精子和卵母細胞提供適宜的環境。該培養液采用碳酸氫鹽緩沖系統，為促進卵母細胞和精子細胞進行有效的新陳代謝創建富含葡萄糖的環境。適用于在5% CO2環境中進行短時間或長時間受精操作。

3）胚胎培養液。小鼠胚胎培養液（KSOM液，Merck Millipore公司產品），包含低濃度NaCl、KCl、乳酸鹽和葡萄糖，用于體外受精早期胚胎培養，支持各種品系小鼠的早期胚胎發育。

2 方法

2.1 小鼠的分組及飼養管理

選取3～4周齡健康雄性小鼠36只，隨機分對照組和試驗組，每組6只，對照組和試驗1，2，3，4，5組分別灌服維生素E 0，20，40，60，80，100 mg／d，共處理30 d，每隔7 d測量1次體重并記錄。試驗小鼠均飼養于控光條件下（光照14 h，05：00—19：00），自由采食和飲水［13］。

2.2 維生素E劑量的換算

已知維生素E軟膠囊400 mg／粒，每瓶100粒，每粒含維生素E 100.0 mg。

單位換算：m＝ρV。式中：m為質量，ρ為密度，V為體積。

ρ（維生素E）＝0.94 g／mL，則對照組和5個試驗組飼喂維生素E的劑量分別為0，21，43，64，86，106μL。

2.3 精液的獲取

飼養30 d后，采用頸部脫臼法處死小鼠，用剪刀剪取附睪和附睪尾，稱重。隨后在潔凈無菌條件下將附睪尾剪3～4個切口，放入預先平衡的HTF液中，于37℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中獲能1.0～1.5 h。獲能處理后的精子用于檢測精子活力和精子密度，或用于體外受精。

2.4 精子密度與精子活力的測定

精子處理后直接送赤峰市婦產醫院生殖中心檢測精子活力和精子密度。

2.5 卵母細胞的獲取方法

選用7～8周齡雌性小鼠36只，購入后適應性飼養3 d，腹腔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG，購自寧波第二激素廠）7.5 IU／只，48 h后注射人絨毛膜促性腺激素（hCG，購自寧波第二激素廠）7.5 IU／只。hCG注射14～16 h后，采用頸部脫臼法處死小鼠，解剖，獲得輸卵管壺腹部（見圖1），于M2操作液中用1 mL注射器輕輕劃開，收集卵丘卵母細胞復合體（COCs，見圖2）。將COCs移入0.1%（W／V）的透明質酸酶中消化，脫去卵丘顆粒細胞，在體視顯微鏡下收集形態正常、胞質均勻、有第一極體排出的卵母細胞供體外受精試驗用［14］。

圖1 小鼠輸卵管壺腹部

圖2 小鼠卵丘卵母細胞復合體

2.6 體外受精及早期胚胎培養

吸取適量已獲能的精子懸浮液加入含有卵母細胞的HTF微滴中。精卵結合4～6 h后，洗去多余精子，移入KSOM液微滴中發育。24 h后統計卵裂率，96 h后統計囊胚率。

2.7 數據的統計分析

試驗中除體重變化采用“平均數”表示外，其余指標均采用“平均數±標準差（Mean±SD）”表示，使用SPSS16.0軟件進行數據分析。

3 結果與分析

3.1 平均體重變化

見表1。

由表1可知，與對照組相比，試驗1，2，3，4，5組小鼠各階段平均體重均無顯著差異（P＞0.05）。說明脂溶性維生素E不會引起肥胖，從而影響精子質量。

表1 各組雄性小鼠體重測定結果 g

3.2 睪丸和附睪尾重量

見表2。

由表2可知，試驗1，2，3，4，5組小鼠睪丸和附睪尾重量與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組雄性小鼠睪丸和附睪尾重量測定結果g

3.3 精子品質

見表3。

由表3可知，試驗2，3組精子活力、精子密度顯著高于對照組和其他試驗組（P＜0.05），試驗1，4，5組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組雄性小鼠精子活力和密度測定結果

3.4 精子受精能力

見表4。

表4 各組精子受精能力測定結果

由表4可知：經過體外受精，卵裂率各組之間均無顯著差異（P＞0.05）；試驗2，3組囊胚率顯著高于對照組（P＜0.05），試驗1，4，5組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

4 討論

本試驗結果表明，雄性小鼠飼喂維生素E可有效提高精子質量。維生素E 劑量為40～60 mg／d的試驗2，3組精子密度、精子活力均顯著高于對照組；而維生素E劑量再增加，精子密度、精子活力則呈下降趨勢。在體外受精試驗中發現，維生素E劑量為40～60 mg／d的試驗2，3組受精后卵裂率與對照組和其他試驗組無顯著差異，但囊胚率顯著高于對照組。可見，精子活力、精子密度與受精能力息息相關。

維生素E為機體內重要的微量營養素，又稱生育酚，具有抗氧化活性，可有效阻止活性氧化物的形成，改善精液品質。2018年，曲揚華［2］在維生素E對綿羊精子發生的影響機制研究中發現，維生素E可通過提高綿羊睪丸細胞活力，參與調控綿羊生精過程中關鍵基因的表達，進而促進精子發生。然而，高劑量維生素E又會導致生精細胞數量減少與凋亡增加，這與本試驗結果一致，即灌服高濃度（80～100 mg／d）維生素E的試驗4，5組精子活力、精子密度低于灌服40～60 mg／d維生素E的試驗2，3組。其影響機制可能與血清甲狀腺激素（T4）水平下降與激素受體基因表達水平下調有關；還可通過睪丸細胞內TGF－β信號通路下調細胞外基質組分膠原蛋白的基因表達，導致細胞外基質含量減少，從而影響精子發生。

精子損傷還包括DNA斷裂，這會導致受精后胎兒畸形或形成死胎，引起流產或無法受孕［10，15］。本試驗中飼喂40 ～60 mg／d維生素E的試驗2，3組體外受精后囊胚率顯著高于對照組。這可能是因為在精子發生過程中，維生素E通過提高過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，抵抗氧化應激，有效保持了精子DNA的完整性［9］。

本試驗采用不同濃度的維生素E飼喂雄性小鼠，飼喂40～60 mg／d范圍對小鼠精子密度、精子活力及提高體外受精能力具有積極作用。維生素E發生作用的濃度存在物種差異，小鼠與豬、羊等動物的有效劑量不同；另外維生素E的劑型對動物有效作用也是有影響的，本試驗中所用的維生素E為油狀軟膠丸，純度與粉末狀維生素E存在差異。

5 結論

灌服維生素E 40～60 mg／d可有效提高小鼠精子活力和精子密度，對小鼠精子的保護作用較好，同時也提高了體外受精效果。