東北狍ARL3基因cDNA克隆及序列分析

薛夢迪，楊鴻源，馬占宇，夏彥玲

（東北林業(yè)大學 野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040）

鹿茸角是所有哺乳動物組織中唯一可以循環(huán)再生的器官，能夠周期性生長脫落［1］，其發(fā)育是一個非常獨特的復雜過程，涉及到軟骨內成骨和膜內成骨等骨生長方式，許多研究表明鹿茸再生是基于干細胞（骨膜細胞），不涉及細胞的去分化，和蠑螈肢體再生過程不相同［2］。

鹿茸角是鹿茸和鹿角的總稱，是鹿科雄性動物（馴鹿除外）的第二性征。東北狍屬于一種中小型鹿科食草動物，劉繼華等［3］的研究表明，狍茸和鹿茸中的化學成分基本相同，都擁有生精補髓、益血壯陽、強筋健骨、促進造血、增強機體免疫力等功效［4］。

近年來有研究表明，ARL3基因參與細胞內微管調節(jié)和蛋白轉運，且和多種生物學過程的發(fā)生、發(fā)展有關［5］，尤其是與人類腦部發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤［6］有著密切的關聯(lián)。人們對ARL3基因與鹿科動物茸角生長相關性方面知之甚少。為此，本試驗對東北狍（Capreolus pygargus）茸角中的ARL3基因進行克隆和序列分析，為深入探討鹿科動物茸角生長發(fā)育的分子調控機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

選取一頭人工馴養(yǎng)的健康成年東北狍（來源于大興安嶺加格達奇地區(qū)）作為試驗動物，在未骨化的狍茸頂端組織中選取大約4 cm樣品，采集樣品時應注意使用嚴格消毒的手術刀。將采集到的樣品放入凍存管，再放置于液氮中保存，備用。

1.2 主要試劑和儀器

RNA提取試劑盒、pMD 18－T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；M－MLVⅢ逆轉錄酶，購自TOYOBO公司；膠純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠快速純化回收試劑盒，購自Galen Biopharm公司；紫外分光光度計（型號為Ultrospec 2100 Pro），購自General Electric公司。

1.3 試驗步驟

1.3.1 總RNA的提取及cDNA合成 將保存于液氮中的試驗樣品約50 mg取出并研磨至粉末狀，按照RNA提取試劑盒說明提取狍茸頂端組織的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光法檢測總RNA的質量。以提取的狍茸尖端組織總RNA為模板，加入抑制劑RNase Inhibitor、底物dNTP Mixture、引物Oligo－dT、以M－MLVⅢ逆轉錄酶反轉錄合成cDNA。

1.3.2 東北狍ARL3基因的克隆 參照GenBank中牛、白唇鹿等物種的基因序列設計同源引物（上游引物5′－GCGGGAGGATGGGCTTAC－3′和下游引物5′－ATCTACGGCTGGAATGGGG－3′）。PCR擴增包含ARL3基因全部編碼區(qū)的cDNA序列，PCR反應體系（25μL）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2.0μL，上下游引物各1.0μL，rTaqDNA聚合酶0.2μL，ddH2O 17.3μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，54.5℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；在4℃進行保存。將產物經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，確認得到目的基因后，利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，將回收產物連接到pMD18－T載體上，轉化到大腸桿菌DH5α中，涂板，于37℃過夜培養(yǎng)。挑取轉化菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6～8 h，經(jīng)PCR陽性克隆檢測后送往庫美生物科技有限公司進行測序。

1.3.3 生物信息學分析 采用ORF程序的ORF Finder軟件查找序列的開放閱讀框，并使用Prot-Param和ProtScale在線程序預測蛋白的基本理化性質及其親水性。用Signal P 3.0軟件預測蛋白信號肽，用TMpred軟件預測蛋白跨膜結構，在PSORTⅡ在線服務器中預測蛋白亞細胞定位。通過GOR4預測該蛋白的二級結構，用SWISSMODEL對該蛋白的三級結構進行同源建模分析，并使用NetPhos 2.0和NetAcet 1.0 Server對ARL3蛋白磷酸化位點和乙?；稽c分別進行預測，用NCBI上的CD－Search Tool預測蛋白功能結構域，用MEGA7軟件構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 東北狍ARL3基因總RNA的提取及cDNA克隆

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取狍茸頂端組織總RNA，RNA條帶中28 S、18 S和5 S均無降解現(xiàn)象，見圖1。這說明提取的總RNA質量較好。PCR擴增獲得1條約721 bp的條帶，見圖2。該條帶與預期目的基因片段大小一致。轉化后經(jīng)陽性克隆獲得了721 bp的條帶，表明成功獲得目的基因。

圖1 RNA完整性檢測結果

圖2 PCR電泳圖譜

2.2 東北狍ARL3基因的生物信息學分析

2.2.1 ARL3基因的cDNA序列分析 本試驗獲得的ARL3基因的cDNA序列長度為721 bp，使用ORF Finder軟件對目的片段的開發(fā)閱讀框進行查找，顯示ARL3基因cDNA 序列的編碼區(qū)包含549 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，共編碼182個氨基酸，見圖3。

圖3 東北狍ARL3基因cDNA編碼區(qū)及編碼氨基酸序列

2.2.2 東北狍ARL3蛋白基本理化性質 東北狍ARL3蛋白包含182個氨基酸，其組成中亮氨酸含量最高，占12.64%。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為44.63，存在16個疏水區(qū)和25個親水區(qū)，親水平均系數(shù)為－0.312，該蛋白的親水性較強；理論等電點為6.83。SignalP 3.0預測結果顯示該蛋白無信號肽。用TMpred軟件進行的跨膜結構預測表明，該蛋白為非跨膜蛋白。亞細胞定位預測分析的結果表明ARL3基因編碼的蛋白存在于細胞質、細胞核、線粒體的概率分別是69.6%、21.7%、4.3%。

2.2.3 東北狍ARL3二級和三級結構預測分析 GOR4軟件預測顯示該蛋白的二級結構組成為61個氨基酸組成無規(guī)則卷曲，84個氨基酸組成α－螺旋，37個氨基酸組成延伸鏈，分別占46.15%、33.52%、20.33%，見圖4。運用ExPASy中的SWISS－MODEL的程序對ARL3蛋白的三級結構進行同源建模，結果表明，與輸入目標序列的一致度為96.11%，GMQE值為0.88，見圖5。該模型圖表明東北狍ARL3蛋白主要由α－螺旋與無規(guī)則卷曲構成，此結果與二級結構預測結果基本相同。

圖4 二級結構預測分析

圖5 三級結構模型

2.2.4 東北狍ARL3蛋白磷酸化位點、乙酰化位點和糖基化位點分析 對東北狍ARL3蛋白磷酸化位點的預測表明，該蛋白含有1個蘇氨酸和5個絲氨酸磷酸化位點，分別是第103位蘇氨酸和第12，43，58，94，137位絲氨酸，不存在酪氨酸磷酸化位點。乙?；稽c預測結果顯示有一個序列（—MGLLS）存在乙酰化修飾。ARL3蛋白中含有20個糖基化位點，其連接位點是甘氨酸。

2.2.5 東北狍ARL3蛋白結構域分析 利用CD Search Tool在線工具進行結構域分析，結果（見圖6）顯示，ARL3蛋白3～175位氨基酸含有一個ARL3蛋白活性結構域，與P－loop＿NTPase超家族相似度很高。ARL3結構域中包含多個功能活性結合位點，包括2個開關轉換區(qū)：switchⅠ和switchⅡ；一個酶類作用位點：GTP／Mg2＋結合位點（GTP／Mg2＋binding site）。

圖6 蛋白功能結構域預測

2.3 東北狍ARL3蛋白系統(tǒng)進化樹的構建

在NCBI網(wǎng)站下載8個物種ARL3蛋白氨基酸序列，并用MEGA7軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果見圖7。結果表明，東北狍與白尾鹿親緣關系最近，與野牦牛、長江江豚、非洲爪蟾的親緣關系較近，與家貓、美洲河貍等的親緣關系較遠，此進化樹符合進化關系，并且與物種傳統(tǒng)分類學地位相符。

圖7 東北狍ARL3蛋白的系統(tǒng)進化樹

3 討論

本試驗中，成功克隆了含有東北狍ARL3基因編碼區(qū)的cDNA序列，其中CDS區(qū)全長549 bp，共編碼182個氨基酸。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，ARL3蛋白為親水性蛋白質且不存在信號肽。經(jīng)ARL3基因的蛋白質序列比對構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)東北狍與白尾鹿親緣關系最近，與野牦牛、長江江豚、非洲爪蟾的親緣關系較近，與家貓、美洲河貍等的親緣關系較遠，符合傳統(tǒng)的分類學進化關系。ARL3蛋白質磷酸化修飾發(fā)生的位點是絲氨酸和蘇氨酸，可能與信號傳導、細胞周期、生長發(fā)育以及癌癥機制有關。其蛋白的O－糖基化連接位點是甘氨酸，許多隱藏的膜結合蛋白在甘氨酸上發(fā)生O－糖基化，這些糖蛋白中大多數(shù)為黏液糖蛋白，常稱黏蛋白。黏蛋白組成了富含多聚糖的膜相關蛋白和分泌性糖蛋白大家族，它們由上皮細胞分泌，是保護黏膜上皮的物理和生物屏障。許多重要的生物進程，包括上皮細胞表層的保護、免疫應答、黏附、炎癥和腫瘤發(fā)生等，都是由黏蛋白或帶有黏蛋白樣結構域的糖蛋白控制和／或調節(jié)的［7］。

ARL3結構域中包含GTP／Mg2＋結合位點，當與GTP結合時ARL3蛋白呈現(xiàn)激活狀態(tài)，當GTP水解為GDP時，蛋白為非激活構象。Mg2＋離子在促進switchⅠ和switchⅡ功能區(qū)與磷酸根結合中起到了關鍵作用，通過激活態(tài)與非激活態(tài)之間的轉變來完成信號傳遞的“開”與“關”，進而調控信號傳導通路和物質代謝［8］。

ARL3蛋白在人腦發(fā)育的早期（包括小腦）以及發(fā)育中的視網(wǎng)膜和腎臟中表達，研究表明，它通過調節(jié)睫狀體運動參與睫狀疾病的發(fā)生，影響腎臟和光感受器的發(fā)展［9］。此外，ARL3基因參與多種生物學過程和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，調節(jié)多種基本的細胞功能，如膜轉運、細胞骨架組織、細胞黏附和遷移等細胞活動，它在免疫突觸和初級纖毛中起著濃縮脂質修飾蛋白的作用［10］，可以作為評估膠質瘤預后的生物標志物，亦或是一個膠質瘤治療的靶點。鹿茸能夠像腫瘤一樣快速生長，鹿茸快速生長期細胞增殖速度是癌細胞增值速度的30倍［11－12］。在鹿茸生長過程中，細胞的分化、增殖、凋亡都受到特定基因表達的調控。

綜上所述，ARL3基因的存在與癌細胞的增殖和轉移有著密切的關系，可能也與鹿茸頂端組織快速生長密不可分。本試驗通過對ARL3基因編碼序列的克隆，對ARL3基因的結構和功能進行了初步分析預測，研究結果為進一步揭示ARL3基因的功能及表達調控機制提供依據(jù)，也為狍茸角的生長發(fā)育機制提供一定的理論依據(jù)。