1 株產(chǎn)色素毛殼菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性

李 亞 唐紹榮 程波普 楊 斌 趙 寧,

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明，650233；2.彌渡縣林業(yè)有害生物防治檢疫局，云南 大理，675600；3.西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明，650233）

色素在人們的日常生活中及各類化工領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，隨著人民生活水平的不斷提高，人們對(duì)于色素質(zhì)量的要求也越來越高[1]。由于生態(tài)文明型社會(huì)發(fā)展的需求，天然色素進(jìn)入了一個(gè)快速發(fā)展的時(shí)代。天然色素來源于天然資源，分為植物色素、動(dòng)物色素、微生物色素和礦物質(zhì)色素[2-3]。天然色素的來源賦予色素較高的安全性，受到了人們的青睞。但植物色素、動(dòng)物色素和礦物質(zhì)色素相對(duì)于微生物色素因?yàn)橘Y源的有限性，發(fā)展受到了一定的限制。而微生物色素因其性質(zhì)穩(wěn)定，生產(chǎn)不受時(shí)間、空間限制等特點(diǎn)更受青睞[4-5]。

現(xiàn)有的研究表明，微生物色素不僅在食品中有著廣泛應(yīng)用，在醫(yī)藥、化妝品、染料等方面也有著很大的發(fā)展前景[6-8]。王金字等[9]介紹了紅曲色素在食品中的應(yīng)用；徐春明等[10]介紹了醌類色素有抗癌、抗菌的作用；徐銀莉等[11]使用紫紅絲膜菌色素對(duì)羊毛織物進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)該色素有較好的染色效果。目前報(bào)道的真菌色素已有600 多種[12]，而對(duì)于已開發(fā)的微生物色素，如黑色素、紅曲色素、藍(lán)色素、黃色素等[13-14]都有了一定的研究，其中對(duì)于紅曲色素的應(yīng)用和研究最為廣泛[15-17]。天然的紅曲色素是一種穩(wěn)定性好，安全性高的色素，不僅能用于傳統(tǒng)的食品染色，還具有抑制膽固醇合成、降血壓、預(yù)防老年癡呆等多種保健功能[18-19]。天然紅色素有重要的應(yīng)用價(jià)值，但是目前用于生產(chǎn)紅色素的微生物菌種非常有限，據(jù)報(bào)道主要為紅曲霉屬（Monascus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）等[1-3,20-21]，因此從自然界中篩選高產(chǎn)紅色素的優(yōu)良菌種具有重要的意義。

毛殼菌（Chaetomiumspp.）屬于子囊菌門（Ascomycota）、核菌綱（Pyrenomycetes）、糞殼菌目（Sordariales）、毛殼菌科（Chaetomiaceae）[22]，其分布廣泛，植物殘?bào)w、土壤、動(dòng)物糞便、木材等類群中都有存在[23]。現(xiàn)有研究表明，毛殼菌主要作為生防菌在植物病害中使用，如球毛殼菌（C.globosum）、角毛殼菌（C.cupreum）、近緣毛殼菌（C.subaffine）等都能產(chǎn)生具有抗菌活性的物質(zhì)，在病原真菌引起的多種植物病害中均有應(yīng)用[24-27]；但目前對(duì)毛殼菌產(chǎn)色素的研究報(bào)道較少。中國(guó)是核桃生產(chǎn)大國(guó)，截至2018 年底種植面積超過795.5 億m2[28]，極易從核桃枝干中獲取毛殼菌。本研究從核桃枝干中分離到1 株產(chǎn)紅色色素的菌株，并通過形態(tài)觀察和分子生物的方法確定該毛殼菌的分類地位，對(duì)其生物學(xué)特性及產(chǎn)色素規(guī)律進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究和應(yīng)用該菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從云南省大理白族自治州云龍縣（海拔2044 m，25°44′47″N，99°34′20″E）采取的核桃枝干上分離得到。

1.2 菌株的分離純化

采用組織分離法從核桃枝干中進(jìn)行菌株的分離，將核桃枝干用自來水清洗干凈，取大小為5 mm×5 mm 的組織塊，用75% 的乙醇浸泡30 s，0.1%的升汞消毒30 s，無菌水清洗3 次，將消毒后的組織塊放置于PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d，待長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落進(jìn)一步培養(yǎng)，于PDA 培養(yǎng)基上獲得編號(hào)為YLHT?2A 的菌株。

1.3 菌株的形態(tài)觀察

將菌株YLHT?2A 接種于PDA 培養(yǎng)基上，放置于25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，每天觀察記錄菌落的生長(zhǎng)特征。在菌落的不同生長(zhǎng)時(shí)期取菌絲放置于載玻片上，載玻片事先滴1 滴蒸餾水，覆蓋上蓋玻片，放置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、孢子等顯微結(jié)構(gòu)。

1.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

用真菌基因組試劑盒提取菌株DNA，以引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC ）進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增[29]。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）為：2×Buffer 25 μL，DNA 模板1 μL，正反引物各1 μL，Taq酶1 μL，ddH2O 21 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，3 min；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送往北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)定的DNA 序列結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，選擇同源性較高的序列在MEGA 7.0 中以Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

1.5 生物學(xué)特性研究

1.5.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)及色素的影響

使用滅菌打孔器打取直徑大小一致的菌塊接種在PDA、SDAY、LB、查氏和淀粉5 種不同的固體培養(yǎng)基上，每種處理做5 個(gè)重復(fù)，將其放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每天觀察并在5、7、10 d 時(shí)以十字交叉法測(cè)量不同培養(yǎng)基上菌落的大小，并在培養(yǎng)至第10 天時(shí)以蒸餾水為溶劑，溫度60 ℃，功率100 W，時(shí)間20 min 的條件，采用超聲提取紅色素并在510 nm 處檢測(cè)吸光值[30-31]，綜合菌落直徑和色素吸光值指標(biāo)，篩選出最佳培養(yǎng)基，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)條件。

1.5.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響

以PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將菌株YLHT?2A 打取相同大小的菌塊放置在5、10、15、20、25、30、35 ℃的條件下培養(yǎng)，每種處理做5 個(gè)重復(fù)，每天觀察并以十字交叉法測(cè)量不同培養(yǎng)溫度下菌落的大小，并在培養(yǎng)至第10 天時(shí)采用超聲粗提取其所產(chǎn)色素，色素含量測(cè)定方法參照1.5.1，綜合菌落直徑和色素吸光值指標(biāo)，篩選出最佳培養(yǎng)溫度。

1.5.3 pH 對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響

將PDA 培養(yǎng)基滅菌后使用1 mol/L 的鹽酸和1 mol/L 的氫氧化鈉將pH 調(diào)節(jié)為4、5、6、7、8、9、10 共7 個(gè)梯度，將菌塊接種于不同處理的培養(yǎng)基上，每種處理做5 個(gè)重復(fù)，每天觀察并以十字交叉法測(cè)量不同培養(yǎng)基上菌落的大小，并在培養(yǎng)至第10 天時(shí)采用超聲粗提取其所產(chǎn)色素，色素含量測(cè)定方法參照1.5.1，綜合菌落直徑和色素吸光值指標(biāo)，篩選出最適合菌株生長(zhǎng)的pH 條件。

1.5.4 光照對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響

以PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將菌株放置在24 h 黑暗，24 h 光照，12 h 光暗交替的培養(yǎng)環(huán)境中，每天觀察并以十字交叉法測(cè)量不同培養(yǎng)基上菌落的大小，并在培養(yǎng)至第10 天時(shí)采用超聲粗提取其所產(chǎn)色素，色素含量測(cè)定方法參照1.5.1，綜合菌落直徑和色素吸光值指標(biāo)，篩選出最佳培養(yǎng)光照條件。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0 軟件，采用LSD 事后多重比較方法對(duì)各處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的菌落特征與形態(tài)鑒定

從核桃枝干中經(jīng)組織分離法篩選得到1 株高產(chǎn)紅色色素的菌株YLHT?2A，其菌落特征及有性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)見圖1。由圖1 可看出，該菌株在生長(zhǎng)的過程中會(huì)有紅色物質(zhì)產(chǎn)生使培養(yǎng)基著色。菌落絨狀，淺黃色，有紅色物質(zhì)溢出，培養(yǎng)基平板變紅色，后期出現(xiàn)明顯的淺黃色和紅白相間的環(huán)紋，邊緣菌落呈淺綠色，培養(yǎng)基平板紅色加深，菌落背面紅色。

圖1 菌株YLHT?2A 的菌落特征及有性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)Fig.1 Colony characteristics and sporulation structure of strain YLHT?2A

將菌株YLHT?2A 的菌絲、子囊、子囊果置于顯微鏡下觀察看出，子囊果表生，反射光下呈灰綠色，卵形或近球形，著生有附屬絲，大小為193～203 μm×91～121.5 μm；子囊果壁細(xì)胞褐色，易破碎，果壁細(xì)胞多為不規(guī)則的多邊形，呈網(wǎng)格狀排列；子囊棍棒狀，具柄，內(nèi)有8 個(gè)子囊孢子，子囊壁易消解，大小為22～30 μm×10～12.5 μm；子囊孢子兩側(cè)不對(duì)稱呈紡錘形或舟形，初期顏色較淺，成熟后呈灰褐色，大小為8.5～11.5 μm×4.5～5.5 μm。

2.2 菌株的分子鑒定

測(cè)序得到菌株YLHT?2A 的ITS 序列長(zhǎng)度為579 bp，將測(cè)序結(jié)果 在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株YLHT?2A 與C.aureum同源性高達(dá)99.46%。選取同源性高的序列在MEGA 7.0 軟件中序列比對(duì)后，根據(jù)Kimura 2?parameter 法計(jì)算遺傳距離，以NJ 法Bootstrap 1000 次后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)圖2 構(gòu)建的ITS 序列進(jìn)化樹可看出，菌株YLHT?2A 與3 株C.aureum菌株在同一分支，Bootstrap 檢驗(yàn)值為99，說明發(fā)育樹表示的菌株YLHT?2A 與3 株C.aureum之間的進(jìn)化關(guān)系可信。結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果及ITS 基因序列的分析結(jié)果，可將菌株YLHT?2A 鑒定為金色毛殼C.aureum[33-35]。將菌株YLHT?2A 的核酸序列提交到GenBank，得到菌株序列號(hào)為MT003228。

2.3 生物學(xué)特性

2.3.1 培養(yǎng)基種類對(duì)YLHT?2A 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響

C.aureumYLHT?2A 菌絲在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)及產(chǎn)色素具有差異性（圖3）。結(jié)果表明，菌絲在5 種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，培養(yǎng)至第10 天時(shí)，PDA 培養(yǎng)基上的菌落直徑達(dá)到4.72 cm，而淀粉培養(yǎng)基上的菌落直徑為5.15 cm，與其他3 種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況存在顯著差異（P<0.05）。而在培養(yǎng)至第10 天時(shí)檢測(cè)不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生的色素含量發(fā)現(xiàn)，PDA 培養(yǎng)基最適合色素分泌，與另外4 種培養(yǎng)基的色素產(chǎn)量差異顯著（P<0.05）。

圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)C.aureum 生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響Fig.3 Effects of different media on C.aureum growth and pigment production

2.3.2 溫度對(duì)YLHT?2A 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響

溫度對(duì)C.aureumYLHT?2A 菌絲的生長(zhǎng)及產(chǎn)色素具有差異性（圖4）。結(jié)果顯示，菌絲在低于15 ℃的條件下不能生長(zhǎng)，而在20～35 ℃的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，并且30 ℃是最適宜C.aureum生長(zhǎng)的，在培養(yǎng)至第10 天時(shí)，其菌落直徑可達(dá)6.48 cm，與其他培養(yǎng)溫度條件存在顯著差異（P<0.05）。

在培養(yǎng)至第10 天時(shí)，提取不同溫度下培養(yǎng)菌株所產(chǎn)的色素發(fā)現(xiàn)，溫度低于15 ℃時(shí)菌株不產(chǎn)生色素，在30 ℃時(shí)菌株所產(chǎn)的色素含量最高，且其色素含量與25 ℃和35 ℃條件下存在顯著差異（P<0.05）。由圖4 可看出，在不同的培養(yǎng)溫度下，C.aureum的菌落生長(zhǎng)速度與色素產(chǎn)生量變化趨勢(shì)一致，30 ℃是最適合C.aureum生長(zhǎng)的溫度。

圖4 溫度對(duì)C.aureum 生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響Fig.4 Effects of temperature on C.aureum growth and pigment production

2.3.3 pH 對(duì)YLHT?2A 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響

圖5 顯示pH 影響菌絲的生長(zhǎng)及產(chǎn)色素情況。C.aureumYLHT?2A 在pH 為4～10 的條件下均能生長(zhǎng)，但在中堿性的條件下生長(zhǎng)狀況更好，且在pH>6 的條件下菌落生長(zhǎng)情況差異不顯著（P>0.05）。

圖5 pH 對(duì)C.aureum 生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響Fig.5 Effects of pH on C.aureum growth and pigment production

在培養(yǎng)至第10 天時(shí)，提取不同pH 下培養(yǎng)菌株所產(chǎn)的色素發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，C.aureum產(chǎn)生的色素較少，pH 為4 時(shí)，其所產(chǎn)生的色素圈顏色較淺。而隨著pH 的增大，色素的含量越高，pH 為10 時(shí)產(chǎn)生的色素含量最大（P<0.05）。而在pH 等于6、7、8 的條件下，其色素含量無明顯差異。

2.3.4 光照對(duì)YLHT?2A 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響

從圖6 中可以看出，不同的光照條件對(duì)C.aureum的菌落生長(zhǎng)情況無顯著差異，在不同光照條件下菌株均可以正常生長(zhǎng)。

圖6 光照對(duì)C.aureum 生長(zhǎng)及產(chǎn)色素的影響Fig.6 Effects of light on C.aureum growth and pigment production

在培養(yǎng)至第10 天時(shí)，提取不同光照條件下培養(yǎng)菌株所產(chǎn)的色素發(fā)現(xiàn)，其所產(chǎn)生的色素在12 h光暗交替的條件與全黑暗和全光照的條件下培養(yǎng)的含量差異不顯著，全黑暗與全光照培養(yǎng)條件下的色素含量存在顯著差異（P<0.05），全黑暗條件下所培養(yǎng)的色素含量顯著高于全光照條件下培養(yǎng)所產(chǎn)生的。

3 結(jié)論與討論

本研究從核桃枝干中分離到1 株產(chǎn)紅色素的菌株YLHT?2A，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法將該菌株鑒定為金色毛殼C.aureum，其最佳培養(yǎng)條件為PDA 培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30 ℃、全黑暗及pH 為10。

通過對(duì)C.aureum在不同環(huán)境下的培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)不同的培養(yǎng)條件下，菌株的生長(zhǎng)速率及色素OD510存在差別。篩選不同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，C.aureum在5 種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但菌落形態(tài)存在差異，綜合菌落生長(zhǎng)和色素OD510的指標(biāo)，判斷PDA 培養(yǎng)基是最佳培養(yǎng)基；篩選最佳培養(yǎng)溫度，發(fā)現(xiàn)菌株在20～35 ℃的條件下均能生長(zhǎng)，低于15 ℃的條件不適合菌落和色素的培養(yǎng)，其中在30 ℃時(shí)最適合C.aureum生長(zhǎng)，此時(shí)菌落生長(zhǎng)速度與色素產(chǎn)生的變化規(guī)律一致；篩選最佳pH，發(fā)現(xiàn)C.aureum在pH 為4～10 的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，對(duì)酸堿度較不敏感，但堿性條件下的生長(zhǎng)狀況要優(yōu)于酸性條件；而C.aureum的產(chǎn)色素情況對(duì)酸堿度較為敏感，在pH 為4 時(shí)，所產(chǎn)的色素較少，隨著堿性增強(qiáng)，色素OD510增大。綜合考慮，堿性條件pH 為10 時(shí)更適合C.aureum生長(zhǎng)；篩選最佳培養(yǎng)光照條件發(fā)現(xiàn)，C.aureum菌株生長(zhǎng)對(duì)光照條件的需求不嚴(yán)格，在24 h全光照、24 h 全黑暗和12 h 光暗交替的條件下均能生長(zhǎng)，且差異不顯著，但C.aureum所產(chǎn)的色素在24 h 全黑暗的條件下OD510更高。

金色毛殼菌C.aureum是一種非常重要的資源真菌，通常被作為生防菌使用[36]。早在1975年[37]，就有人對(duì)其進(jìn)行了研究。Wang 等[38]探究發(fā)現(xiàn)C.aureumMF?91 對(duì)稻瘟病菌和紋枯病菌有一定的抑制作用；Kabbaj 等[39]對(duì)C.aureum產(chǎn)生的活性物質(zhì)進(jìn)行了研究，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)C.aureum的研究主要集中在其生防作用上。李靜等[33]對(duì)多種毛殼菌的生長(zhǎng)溫度特性進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)菌株生長(zhǎng)溫度可以作為毛殼屬物種鑒定的一個(gè)指標(biāo)。而對(duì)于C.aureum可以分泌色素的情況，譚悠久[34]在其分類鑒定得到的菌株中發(fā)現(xiàn)C.aureum可以產(chǎn)生無色分泌物；張豐[35]鑒定得到的C.aureum可以產(chǎn)生紅色分泌物使PDA 培養(yǎng)基變紅，說明不同的菌株在生物學(xué)特性方面會(huì)存在一定的差異。但對(duì)其產(chǎn)色素的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。天然微生物色素在色素市場(chǎng)上具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力，開發(fā)新的可產(chǎn)色素的菌株對(duì)于色素市場(chǎng)有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前主要的微生物色素有紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫、褐色和黑色等，其中天然紅色素被廣泛的應(yīng)用到食品和醫(yī)療行業(yè)，產(chǎn)紅色素的菌株以紅曲霉研究最多[40]。目前市場(chǎng)上真菌所產(chǎn)的紅色素，如張立強(qiáng)等[41]研究的黑曲霉菌（Aspergillus niger）所產(chǎn)的紅色素在pH 為5～9 的條件下保持穩(wěn)定；劉維等[42]對(duì)一株鐵皮石斛內(nèi)生真菌所產(chǎn)的紅色素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌所產(chǎn)色素對(duì)自然光和溫度較為穩(wěn)定，而在pH>7的環(huán)境下穩(wěn)定性更好，本研究中的C.aureum在pH 為4～10，以及不同光照條件下均能繼續(xù)分泌紅色素，說明菌株YHLT?2A 所產(chǎn)的色素有著極好的穩(wěn)定性，對(duì)酸堿的耐受性較好，有進(jìn)一步開發(fā)利用的潛力。本研究從核桃中分離得到了1 株產(chǎn)紅色素的毛殼菌，拓寬了產(chǎn)紅色素菌種資源的來源。對(duì)該菌株進(jìn)行了形態(tài)和分子描述，并對(duì)該菌株的基本培養(yǎng)特性與產(chǎn)色素之間的關(guān)系進(jìn)行了探究，為毛殼菌屬菌種資源的分類鑒定及開發(fā)利用提供了相關(guān)理論依據(jù)。