不同產地高節竹竹葉次生代謝物與土壤微生物的關系分析

徐小博 王選年 徐 萍 岳永德 湯 鋒 王 進 姚 曦

（1.新鄉學院生命科學與基礎醫學學院，河南 新鄉 453003；2.國際竹藤中心，北京 100102）

土壤是影響植物次生代謝成分的主要因素，土壤微生物是土壤生態系統的核心，土壤微生物不僅對土壤動植物殘體和土壤有機物質及其他有害化合物的分解起到重要作用，而且在土壤養分循環和土壤結構變化中的作用也不能忽視，在一定程度上可以反映土壤肥力狀況及其生產力水平[1-3]。例如叢枝菌根（AM）真菌是土壤生態系統中廣泛分布的優秀微生物資源，AM 真菌通過根內菌絲與宿主植物體形成營養上的互利共生關系，在促進植物生長、提高抗逆性、改良土壤結構等方面的作用效果顯著[4]。藥用植物與根際微生物互作一直是研究的熱點[5]。黃花蒿（Artemisia annua）、刺五加（Acanthopanax senticosus）和魚腥草（Houttuynia cordata）等藥用植物的次生代謝產物與土壤因子關系[6-8]、以及土壤有益菌對植物次生代謝產物影響的研究較多[9]。通過對野生黃花蒿（Artemisia annua）土壤特征對藥用次生代謝產物的影響研究發現，土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性與青蒿素、青蒿酸含量呈顯著或極顯著正相關。提高土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性能夠提高黃花蒿的青蒿素、青蒿酸含量[6]。金司陽等從植物?土壤反饋角度結合次生代謝產物的含量方法，分析了刺五加幼苗在植物?土壤反饋中的次生代謝產物的變化情況[7]。竹葉中含有豐富的黃酮類、有機酸等次生代謝產物，有重要的藥用價值，但存在活性成分含量不穩定等問題[10-11]。植物產地是影響植物次生代謝產物的重要因素之一，不同地區環境中微生物種類和優勢菌群不盡相同[11-12]。竹子次生代謝產物的研究多集中在次生代謝產物的種類和時間變化上[13-14]，但地域差異對竹葉次生代謝產物影響的研究較少，竹葉次生代謝產物的產地差異及其與竹林土壤微生物特征之間的關系尚不清楚。此外，竹葉中次生代謝產物會通過淋溶、凋落物等途徑進入土壤，對土壤微生物群落產生影響，進而間接影響植物的生長發育，這個問題也同樣值得關注。

高節竹（Phyllostachys prominens）為禾本科竹亞科剛竹屬的重要經濟竹種，是一種集觀賞、生態防護、筍用、材用于一體的多用竹種，主要在分布浙江，全國多地有引種，經濟價值高[15]。因此，本研究以高節竹為試材，測定了不同產地高節竹竹葉次生代謝產物含量以及土壤中3 種土壤微生物數量、微生物生物量和土壤酶活性，探討竹葉中次生代謝產物含量與土壤微生物因子的相關性。本研究為了解土壤微生物對竹葉次生代謝產物積累的影響，以及不同竹林目標化種植和提高次生代謝產物累積的研究提供參考。

1 研究地概況

由南向北選擇4 個有高節竹分布或者引種的代表性研究地，分別為江蘇南京、浙江富陽、江西南昌、福建武夷山。研究地的基本概況如下：1）江蘇南京：位于南京市溧水區東南部的南京林業大學白馬基地（119°10′～119°11′E、31°35′～31°36′N），屬亞熱帶季風氣候。年平均氣溫15.4 ℃年，平均降雨量1106.5 mm。2）浙江富陽：位于杭州市富陽區永昌鎮（119°25′～120°19.5′E、29°44～30°11′N），屬中亞熱帶季風氣候。年平均氣溫16.1 ℃，年平均降水量1 426 mm。3）江西南昌：位于南昌市梅嶺國家森林公園塘下村（115°48′～115°49′E、28°44′～28°45′N），屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫17～17.7 ℃，年平均降雨量1600～1700 mm。4）福建武夷山：位于福建省武夷山風景區（117°24′12″～118°02′50″E，27°32′36″～27°55′15″N），屬典型的亞熱帶季風氣候，年平均氣溫8.5～18.0 ℃，年平均降雨量1 482～2 150 mm。

2 材料與方法

2.1 竹葉樣品采集和處理

在4 個研究地，選擇高節竹試驗林經營水平一致，長勢良好的高節竹竹林，分別設置3 個20 m×20 m 的樣地，每個樣地 中隨機設 置3 個3 m×3 m 的小樣方。在每個小樣方采集竹葉，采集立竹年齡為2 a 的上、中、下部的健康葉片，然后混勻，取樣量500 g。每個試驗地共9 個竹葉樣品。樣品采集后自然陰干至恒質量，粉碎，保存于4 ℃冰箱中。竹葉采樣時間在2018 年9 月中旬。

2.2 土壤樣品的采集

在2.1 的每個樣地內布設5 個土樣采集點，采集0～20 cm 深度的土壤樣品，取樣時去除土壤表層凋落物及其他雜物，并剔除土壤中植物根系和石塊。每個樣品采樣量為1.0 kg 左右，共20 份樣品，裝入無菌袋放于帶冰塊的泡沫箱內，帶回實驗室，用于土壤微生物數量、土壤微生物生物量及土壤酶活性的測定。

2.3 儀器與試劑

Waters 2695 型高效液相色譜儀，Waters 2487二極管陣列檢測器；異葒草苷、葒草苷、對香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷、苜蓿素7?O?葡萄糖苷、木犀草素、芹菜素（純度>98%）（上海源葉生物生物技術有限公司）；色譜乙腈，（美國Fisher 公司）。

2.4 高效液相色譜檢測方法

標準溶液配制、樣品制備及HPLC 檢測條件參考魏琦等的方法[16]，10 種次生代謝產物標準品的高效液相色譜見圖1。按照保留時間依次是異葒草苷、葒草苷、對香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷、苜蓿素7?O?葡萄糖苷、木犀草素和芹菜素。

圖1 10 種次生代謝產物標準品的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of 10 secondary metabolites

2.5 土壤微生物相關指標的測定方法

細菌、真菌和放線菌數量測定參考許光輝等[17]和王理德等[18]的方法，微生物數量用cfu/g（每克樣品的菌落數）表示。

土壤微生物生物量碳（SMBC）和生物量氮（SMBN）測定參考文獻[19]方法。蛋白酶活性和脲酶活性的測定采用比色法測定[20]，蔗糖酶活性采用3,5?二硝基水楊酸比色法[21]。

2.6 數據分析與處理

采用Microsoft Excel 2010 計算數據平均值、標準差等，并完成圖表制作。采用SPSS 19.0 軟件進行Pearson 法相關分析。

3 結果與分析

3.1 不同產地高節竹竹葉次生代謝含量分析

由表1 可知，4 個產地高節竹竹葉中所含次生代謝產物種類一致，被檢測的次生代謝產物總量在1.777 9～3.176 2 mg/g，其中異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、苜蓿素7?O?葡萄糖苷含量高于其他成分。不同產地高節竹竹葉中異葒草苷的含量在0.877 3～2.133 6 mg/g，其中，浙江富陽最高，是福建武夷山（最低）的2.43 倍。各產地竹葉中葒草苷含量在0.308 2～0.573 1 mg/g。各產地竹葉中牡荊苷含量在0.167 1～0.258 9 mg/g，浙江富陽的顯著高于其他3 個產地，是江蘇南京（最低）的1.55倍。各產地竹葉中苜蓿素7?O?葡萄糖苷含量在0.101 8～0.256 3 mg/g。浙江富陽的最高，是江西南昌（最低）的2.52 倍，但和江蘇南京差異不顯著。各產地的對香豆酸的含量在0.007 9～0.020 5 mg/g，異牡荊苷的含量在0.008 9～0.016 5 mg/g，蘆丁的含量在0.044 1～0.061 3 mg/g，木犀草苷的含量在0.053 2～0.144 9 mg/g，芹菜素的含量在0.010 0～0.028 5 mg/g。4 個產地均未檢測到木犀草素。

表1 4 個產地竹葉樣品中9 種次生代謝物的含量Table 1 Contents of 10 secondary metabolites from 4 producing areas mg/g

3.2 不同產地高節竹林土壤微生物相關指標分析

由表2 可知，4 個研究區的土壤微生物總量由高到低依次是福建武夷山、浙江富陽、江蘇南京和江西南昌。福建武夷山的土壤細菌數量最高，為17.50×106cfu/g，依次分別是浙江富陽（9.25×106cfu/g）、江蘇南京（8.94×106cfu/g）和江西南昌（7.36×106cfu/g），其中浙江富陽和江蘇南京兩地差異不顯著。土壤真菌數量為江蘇南京土壤樣品最高，為3.99×104cfu/g，顯著高于其他3 個產地，浙江富陽、江西南昌和福建武夷山的土壤真菌數量相互之間差異顯著。福建武夷山的放線菌數量顯著高于浙江富陽、江西南昌和江蘇南京，為4.33×104cfu/g，江蘇南京和江西南昌竹葉樣品之間差異不顯著。

表2 不同產地竹林土壤3 種微生物數量的比較Table 2 Comparison of soil microbial quantity in bamboo from different producing areas cfu/g

由表3 可以看出，浙江富陽的土壤樣品SMBN顯著高于福建武夷山、江西南昌和江蘇南京。浙江富陽的土壤樣品SMBC 最高，依次分別是江西南昌、江蘇南京和福建武夷山的土壤樣品。江西南昌和福建武夷山的樣品的SMBN 之間差異不顯著；福建武夷山樣品的SMBC 顯著低于其他地區的，浙江富陽和江蘇南京樣品的SMBN 差異不顯著。

表3 不同產地土壤微生物量碳和氮及3 種土壤酶的比較Table 3 Comparison of soil microbial biomass C and N,and 3 enzyme activities from different areas

由表3 可以看出，來自江蘇南京土壤樣品的脲酶和蔗糖酶活性顯著高于其他地區的，4 個產地樣品中浙江富陽的蛋白酶活性最高，依次分別是福建武夷山、江蘇南京、江西南昌；江蘇南京的土壤脲酶活性最高，依次分別是福建武夷山、江西南昌和浙江富陽。江蘇南京的高節竹林土壤蔗糖酶活性最高，依次分別是江西南昌、福建武夷山和浙江富陽。

3.3 竹葉次生代謝含量與土壤微生物的相關性分析

由表4 可知，竹林土壤細菌數量與竹葉中葒草苷、對香豆酸和牡荊苷含量存在正相關關系，與異葒草苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷、苜蓿素?7?O?葡萄糖苷、芹菜素和總量存在負相關關系；土壤真菌數量與竹葉中異葒草苷和木犀草苷含量存在顯著正相關關系，與葒草苷、對香豆酸和牡荊苷存在負相關關系；土壤放線菌與葒草苷、對香豆酸、牡荊苷含量存在正相關關系，與異葒草苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷、芹菜素和次生代謝產物總量存在負相關關系；微生物量氮和微生物量碳均與竹葉中異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、木犀草苷、苜蓿素?7?O?葡萄糖苷和次生代謝產物總量存在正相關關系，與對香豆酸、異牡荊苷和芹菜素存在負相關關系，其中與對香豆酸含量存在顯著負相關關系。高節竹竹葉次生代謝相關產物的含量與土壤中3 種酶活性的相關性不顯著。說明土壤酶活性不是活化土壤所吸收養分的主要因素。

表4 竹葉次生代謝產物含量和土壤微生物的相關性Table 4 Correlation between content of secondary metabolites in bamboo leaves and soil microorganism

4 結論與討論

1）不同產地次生代謝物差異。植物所含次生代謝產物含量的高低除與遺傳因素有密切關系外，所生存的環境和氣候條件等生態因子對其也有很大的影響。本研究中高節竹竹葉中代謝產物的總量具有明顯的地域差異，表明竹葉中次生代謝產物的合成和積累受環境因子的影響較大。各氣象因子如溫度、濕度、光照、大氣以及生物之間的影響程度等綜合決定的環境因子對植物次生代謝過程的影響，所以環境因子并不是孤立地對植物體內次生代謝產物含量起作用，而是多種因素不斷變化[22]。

2）土壤微生物數量與竹葉次生代謝物的關系。植物體內次生代謝物的量和土壤微生物存著相互關系。土壤微生物也會通過參與土壤有機質分解、礦質元素運輸而影響植物自身次生代謝物的合成，尤其是一些土壤有益菌發揮的作用更不容忽視。植物根際促生菌（PGPR）和菌根真菌（AM）對植物生長、養分吸收和次生代謝物的產生具有有益的影響，這些植物的次生代謝物包括酚類、黃酮、生物堿等[3,23]。相關性分析表明竹林土壤細菌數量與竹葉中葒草苷、對香豆酸和牡荊苷含量存在正相關關系。研究也發現土壤微生物與魚腥草次生代謝相關產物存在相關性。細菌群與阿福豆苷和槲皮素含量呈極顯著正相關，細菌群落對于酚類物質中的阿福豆苷、槲皮苷、槲皮素的代謝累計起到一定的促進作用[24]。推測某些竹林土壤細菌的生理活動，影響了土壤養分及根系，進而促進了竹葉中葒草苷、對香豆酸和牡荊苷的生物合成及積累。土壤真菌數量與竹葉中異葒草苷和木犀草苷含量存在顯著正相關關系，推測在高節竹竹林土壤可能存在某些菌根真菌，能通過菌絲體將礦質營養運輸到植物根際供其吸收，促進高節竹體內某些次生代謝產物合成，值得進一步研究。

3）土壤酶活性與竹葉次生代謝物的關系。本研究還發現4 個產地竹葉中異葒草苷的含量均顯著高于其他成分，浙江富陽的異葒草苷的含量最高，同時該地土壤中蛋白酶活性也最高，推測土壤蛋白酶也間接影響著異葒草苷的生物合成，有機質中的絕大多數化合物不能直接被植物吸收利用，需要借助土壤中微生物釋放的酶來分解[25-26]。但通過顯著性分析發現高節竹竹葉次生代謝相關產物的含量與土壤中3 種酶活性的相關性不顯著。馮玄在研究次生代謝產物與土壤特征的相關性時也發現，魚腥草次生代謝相關產物的含量與土壤中的酶活性相關性不顯著。說明在高節竹和魚腥草這2 種植物上，土壤酶活性不是活化土壤所吸收養分的主要因素[24]。但是，趙鋮等研究表明土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性與青蒿素、青蒿酸含量呈顯著或極顯著正相關。提高土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性能夠提高黃花蒿的青蒿素、青蒿酸含量[6]。說明不同植物的不同次生代謝產物對土壤相關酶降解的養分需求不同。

不同產地高節竹竹葉中次生代謝物的種類一致，且均為異葒草苷含量最高，但不同產地的含量差異明顯。竹林土壤細菌數量與竹葉中葒草苷、對香豆酸和牡荊苷含量存在正相關關系，土壤真菌數量與竹葉中異葒草苷和木犀草苷含量存在顯著正相關關系。綜上所述，土壤微生物特征能夠影響高節竹竹葉次生代謝產物的積累，但是不同次生代謝產物對土壤微生物特征的響應不同增加土壤細菌可以提高高節竹竹葉葒草苷、對香豆酸和牡荊苷含量，增加土壤真菌可以提高高節竹竹葉異葒草苷和木犀草苷。在實際生產中可以嘗試調節土壤微生物特征來實現高節竹竹葉目標次生代謝成分的提高。