CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1在結直腸癌中的表達及意義

王月嬌　　史學森　　白雪峰

[摘要] 目的 探討結直腸癌中CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1的表達情況，并分析其相關性及臨床病理學意義。 方法 收集2019年1—12月包頭市腫瘤醫院手術切除的結直腸癌腫物及癌旁5 cm、10 cm石蠟組織標本各41例，免疫組化法檢測CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1的表達水平，Sanger測序法檢測微衛星不穩定性。 結果 結直腸癌癌組織CD4+T細胞表達陽性的細胞數為108.8個，高于癌旁5 cm的73.8個及癌旁10 cm的38.0個，差異有統計學意義（P<0.05）;癌組織CD8+T細胞表達陽性的細胞數為63.8個，高于癌旁5 cm的33.8個及癌旁10 cm的22.4個，差異有統計學意義（P<0.05）;癌組織PD-L1表達陽性的細胞數為18.0個，高于癌旁5 cm的3.2個及癌旁10 cm的1.2個，差異有統計學意義（P<0.05）。神經侵犯、脈管癌栓與結直腸癌癌組織CD4+T細胞表達相關，MSI、淋巴結轉移、脈管癌栓與CD8+T細胞表達有關，MSI、淋巴結轉移、神經侵犯、脈管癌栓與PD-L1的表達均無關。PD-L1和CD8+T細胞的表達呈低度正相關（r=0.350，P<0.05），PD-L1與CD4+T細胞表達無相關性（r=0.138，P>0.05）。 結論 CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1在癌組織高表達，CD8+T與CD4+T細胞兩者的高表達可作為預后良好的輔助判斷指標，PD-L1與CD8+T細胞表達呈正相關。

[關鍵詞] 結直腸癌;CD4+T細胞;CD8+T細胞;PD-L1;微衛星不穩定性

[中圖分類號] R735.35? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）09-0152-04

The expression and significance of CD4+T， CD8+T cell and PD-L1 in colorectal cancer

WANG Yuejiao1? ?SHI Xuesen2? ?BAI Xuefeng3

1.Graduate School of Baotou Medical College， Baotou? 014040， China; 2.Baotou Center for Disease Control and Prevention in Inner Mongolla Autonomous Region， Baotou? 014030， China; 3.Department of Pathology， Baotou Cancer Hospital in Inner Mongolla Autonomous Region， Baotou? 014030， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of CD4+T cells， CD8+T cells and PD-L1 in colorectal cancer， and to analyze their correlation and clinicopathological significance. Methods 41 cases of colorectal cancer tumors and paraffin tissue specimens 5 cm and 10 cm adjacent to the cancer were collected from Baotou Cancer Hospital from January to December 2019. The expression levels of CD4+T， CD8+T cells and PD-L1 were detected by immunohistochemistry， and the microsatellite instability was detected by sanger sequencing method. Results The number of CD4+T cells in colorectal cancer tissues was 108.8， which was higher than 73.8 cells in 5 cm adjacent to cancer and 38.0 cells in 10 cm adjacent to cancer， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The number of CD8+ T cells in cancer tissue was 63.8， which was higher than 33.8 in 5 cm and 22.4 in 10 cm adjacent to cancer（P<0.05）; The number of PD-L1 positive cells in cancer tissue was 18.0， which was higher than 3.2 in 5 cm and 1.2 in 10 cm adjacent to cancer（P<0.05）. MSI， lymph node metastasis and vascular tumor thrombus were related to the expression of CD8+T cells. MSI， lymph node metastasis， nerve invasion and vascular tumor thrombus were not related to the expression of PD-L1. There was a low positive correlation between the expression of PD-L1 and CD8+T cells（r=0.350， P<0.05）， but no correlation between the expression of PD-L1 and CD4+T cells（r=0.138， P>0.05）. Conclusion CD4+T cells， CD8+T cells， and PD-L1 are highly expressed in cancer tissues. The high expression of CD8+T cells and CD4+T cells can be used as auxiliary indicators for a good prognosis. The expression of PD-L1 is positively related to CD8+T cells.

[Key words] Colorectal cancer; CD4+T cells; CD8+T cells; PD-L1; Microsatellite instability

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，其發病率在所有惡性腫瘤中位居第三位[1]。近年來CRC的死亡率明顯上升，因此深入研究并尋找新的治療策略意義重大。腫瘤浸潤淋巴細胞（Tumor infiltrating lymphocytes，TIL）是腫瘤細胞免疫的重要組分，CD8+T細胞是主要的抗腫瘤效應細胞，CD4+T細胞則促進其活化增殖，二者協同可對抗腫瘤。程序性死亡因子-1（Programmmed death-1，PD-1）/程序性死亡因子配體-1（Programmmed death ligand-1，PD-L1）屬負性刺激分子，可誘導T細胞衰竭，促進腫瘤進展[2]。目前PD-L1的抗體阻斷治療已在微衛星不穩定（Microsatellite instability，MSI）型CRC中取得較為可觀的療效。但前期研究中PD-L1與CD4+T細胞、CD8+T細胞的關系分析卻少有報道。本研究旨在檢測CRC癌組織和癌旁組織中CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1的表達水平，并分析其相關性及意義，為CRC的預后判斷及免疫治療提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1—12月包頭市腫瘤醫院手術切除的CRC腫物及癌旁5 cm、10 cm石蠟組織標本各41例，均為首次切除，且無結直腸免疫相關病史，術前亦未行放化療或生物免疫治療。其中男34例，女7例，年齡46～79歲，平均（62.63±8.47）歲;結腸癌21例，直腸癌20例;脈管癌栓陽性19例，陰性22例;神經侵犯陽性17例，陰性24例;淋巴結轉移陽性19例，陰性22例;MSI陽性7例，陰性34例。年齡、性別、腫瘤部位、脈管癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移資料從原病歷中獲取。本研究已通過包頭市腫瘤醫院醫學倫理委員會批準，并簽署知情同意書。

1.2 試劑

CD4兔單克隆抗體（克隆號SP35）、CD8兔單克隆抗體（克隆號SP16）、PD-L1兔單克隆抗體（克隆號MXR003）、免疫組化S-P法檢測試劑盒、DAB試劑盒均購自福建邁新生物工程有限公司;石蠟包埋組織DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;MSI基因檢測試劑盒購自北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1 以切片的方式處理石蠟包埋組織，獲得4.0 μm厚度的薄片，在載玻片上粘附后，置于65℃環境下持續2 h烘烤，再進行脫蠟，0.01 M EDTA（pH=9.0）高壓修復2.5 min，自然冷卻后，滴加0.3%的H2O2 10 min，一抗37℃孵育1 h，二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精復染，再經分色、返藍、脫水、透明后封片，讀片觀察結果。

1.3.2 Sanger法檢測MSI? 將石蠟包埋組織切片置于1.5 mL無菌離心管中，提取基因組DNA，并檢測濃度，然后稀釋后進行Sanger法測序，分析結果。

1.4 結果判讀

1.4.1 免疫組化結果判定標準? 采用病理切片掃描儀掃描切片，NDP.View2軟件觀察，于低倍視野下選取5個陽性細胞數最多的區域，然后將視野放大30倍，計陽性細胞數，取平均值。當細胞膜被染成棕色時，CD4+T細胞、CD8+T細胞為陽性，細胞膜與細胞質或是兩者之一呈現棕黃色時，PD-L1為陽性[3-4]。

1.4.2 判定MSI的標準? 微衛星不穩定現象發生在兩個或多個微衛星DNA標記位點上，稱為MSI（+），只發生在一個或更少的位點上稱為MSI（-）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件分析數據，其中PD-L1在癌旁5 cm和10 cm處的表達數據不呈正態分布，CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1的表達數據均顯示方差不齊，因此三者表達及比較均選擇非參數Kruskal-Wallis法，通過Bonferroni對組間兩兩比較進行校正，采用[M（Q1，Q3）]進行描述。相關性分析采用Pearson相關分析法。癌組織中三種標志物表達量與病理參數關系的分析采用二元Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1在CRC癌組織、癌旁5 cm和10 cm的表達水平比較

CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1在CRC癌組織和癌旁組織中均有表達。CD4+T細胞在癌組織中的表達水平高于癌旁組織，在癌旁5 cm的表達水平高于癌旁10 cm，差異有統計學意義（P<0.05）。CD8+T細胞和PD-L1在癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05），而其在癌旁5 cm和癌旁10 cm的表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 CRC癌組織CD4+、CD8+T細胞和PD-L1的表達與脈管癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移及MSI的二元Logistic回歸分析

CD4+T細胞在CRC癌組織中的表達與脈管癌栓和神經侵犯相關（P<0.05），與淋巴結轉移和MSI無關（P>0.05）。CD8+T細胞的表達與脈管癌栓、淋巴結轉移和MSI相關（P<0.05），與神經侵犯無關（P>0.05）。PD-L1的表達與脈管癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移和MSI均無關（P>0.05）。

2.3 CRC癌組織內CD8+T細胞與CD4+T細胞兩者和PD-L1表達間的相關性分析

通過Pearson分析發現，CRC癌組織內PD-L1與CD8+T細胞的表達呈低度正相關（r=0.350，P=0.025），與CD4+T細胞無相關性（r=0.138，P=0.390）。

3 討論

TIL在腫瘤的發生及惡性進展中發揮了重要作用。在腫瘤發生初期，免疫系統可檢測并清除已發生的腫瘤細胞，此為免疫清除階段。該階段既可使腫瘤細胞完全被清除，也可僅清除部分腫瘤細胞。在部分清除情況下，幸存的腫瘤細胞變體與宿主免疫系統將進入一種動態平衡。在平衡階段，免疫系統對腫瘤細胞施加一種強有力的選擇性壓力，足以抑制但不能完全殺滅許多遺傳不穩定且快速變異的癌細胞。在此選擇期間，原腫瘤細胞的很多逃逸變種被破壞，出現新的變種，攜帶不同的突變基因，使它們的抗免疫攻擊能力增強。總之，免疫系統未能完全清除腫瘤，卻篩選出能抵抗免疫應答的腫瘤細胞，導致逃逸階段的出現[5]。在癌癥等慢性炎癥部位T細胞長期激活會發生衰竭，衰竭的T細胞高水平表達受體PD-1。PD-L1與PD-1兩者結合會在T細胞受體周圍引起一系列的負性調節作用，有效防止T細胞活化，損害了T細胞的免疫功能，致使腫瘤發生免疫逃逸[6]。

本研究結果顯示，CRC癌組織中CD4+T細胞、CD8+T細胞和PD-L1的表達均顯著高于癌旁5 cm及癌旁10 cm。周瑋等[7]研究發現，在50例散發性結直腸癌中CD4+T細胞、CD8+T細胞的表達率均較相應的癌旁組織高，Hua等[8]發現，PD-L1在正常大腸組織內無表達或低表達，在CRC癌組織中顯著高表達，這與本研究結果類似。由此可見宿主確實對結直腸癌產生了免疫應答反應，使癌組織中的免疫效應細胞聚集增加。但結直腸癌的進展沒有因為大量的淋巴細胞浸潤而終止，其原因可能是腫瘤組織內高表達的PD-L1激活了PD-1/PD-L1通路，降低了T淋巴細胞活性，使癌細胞未能被完全清除而發生了逃逸。

目前針對各種T淋巴細胞亞型的研究發現，高度浸潤的TIL可作為判斷患者預后的重要指標。Taichi等[9]和Kuwahara等[10]的研究均證實CD4+T淋巴細胞的高表達與患者的良好預后相關，還有大量的研究證據顯示，CD8+TIL的密度與不同類型癌癥患者的長期生存均相關[11-12]，但目前國內外關于PD-L1在CRC中的表達與臨床病理參數及預后的相關性報道尚無明確共識。本研究采用Logistic回歸分析的方法得出，CRC癌組織中CD4+T細胞的浸潤程度越高發生脈管癌栓和神經侵犯的風險越低;CD8+T細胞的表達量越多，發生脈管癌栓、淋巴結轉移及微衛星不穩定性的概率也越低。脈管癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移陰性均是預后良好的表現，且已有學者認為MSI狀態下的CRC預后相對較好[13-14]，因此本研究結果與上述研究結果一致。

T淋巴細胞不僅可用來評估預后，還可利用其自身的免疫活性用于腫瘤的免疫治療。以T細胞為基礎的細胞免疫療法，在惡性黑色素瘤、乳腺腫瘤及血液系統惡性腫瘤的治療方面已取得了一定進展[15]。但是由于腫瘤微環境中的T細胞經常被抑制，導致腫瘤組織浸潤T細胞數量少、活性低，嚴重影響治療效果。抗PD-1/PD-L1單克隆抗體可有效抑制PD-1/PD-L1信號傳導通路，其在多種實體腫瘤中的治療效果已得到證實[16-18]。諸多研究證明，阻斷PD-1或PD-L1等免疫檢查位點能增加腫瘤部位的T細胞數量，提高T細胞的免疫殺傷功能[19]。因此T細胞免疫治療與免疫檢查位點阻斷二者相結合，將有望提升腫瘤治療效果，成為腫瘤治療研究的新觀點。本研究結果顯示，CRC癌組織中PD-L1與CD8+T細胞的表達存在低度正相關，進一步證實了Sudoyo等[20]的觀點，認為PD-L1在CRC中的表達主要是由于CD8+T淋巴細胞的浸潤所致。這將為腫瘤免疫治療策略提供重要的理論依據。

綜上所述，TIL亞群CD4+T、CD8+T細胞和PD-L1在CRC癌組織中高度浸潤。TIL有助于機體對抗腫瘤和提高預后，而PD-L1有可能影響TIL對腫瘤的殺傷作用，促使腫瘤發生免疫逃逸。因此，TIL細胞免疫治療與PD-L1阻斷劑結合有望開創腫瘤免疫治療的新局面。PD-L1與CD8+T細胞的正相關性，也將為其提供理論支持。

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（收稿日期：2020-10-16）