朱砂葉螨硒代謝通路基因篩選及硒磷酸合成酶TcSPS1的原核表達和特性分析

張夢宇, 戚翠翠, 胡 佳, 徐志峰

(西南大學植物保護學院, 重慶400715)

硒是哺乳動物和許多細菌、藻類等生物的一種必需微量元素，在自然界中主要以亞硒酸鹽的形式存在(韓曉霞等, 2012)。在選擇性取食研究中，植食性害蟲在取食了富硒植物后，選擇轉移到低硒植物上取食，例如甜菜夜蛾Spodopteraexigua對不同形式和濃度的硒的攝食反應中，添加到飼料中的硒會影響甜菜夜蛾對宿主植物的選擇，一定濃度下的硒可以作為甜菜夜蛾幼蟲的拒食劑(Vickerman and Trumble, 1999)。在非選擇性取食研究中，大量的植食性昆蟲被迫食用富含硒的超積累體植物后都表現出中毒和高死亡率，例如蟋蟀取食富硒植物芥菜Brassicajuncea后會大量死亡(Freemanetal., 2007)。這些研究表明，植物可以通過富集硒來防御食草動物和病原體的攻擊，植物硒含量的增加會影響食草動物的取食、生長、繁殖，甚至導致其死亡。硒在昆蟲生理上的最適范圍很窄，超過臨界濃度則毒性很強，因此硒在植物對害蟲的防御中具有重要意義。

耐硒的小菜蛾Plutellaxylostella取食十字花科植物醉蝶花羽葉Stanleyapinnata后同樣積累了甲基硒代半胱氨酸，而對硒敏感的小菜蛾則以積累硒代半胱氨酸為主，研究人員推測出現這種差異的原因是耐硒小菜蛾具有防止甲基硒代半胱氨酸轉化或降解為其他更有毒形式的能力(Freemanetal., 2006)。在甜菜夜蛾的成蟲中發現了類似于三甲基硒化物的物質，表明甜菜夜蛾成蟲可以通過甲基化和揮發來解毒過量的硒(Vickermanetal., 2004)。相對于其他害蟲，葉螨對硒有著更強的適應能力，二斑葉螨Tetranychusurticae可以為害含有200 mg/kg硒的黃芪屬植物，而該濃度對許多其他植食性害蟲都是有一定毒性的，可能是由于二斑葉螨通過體內富集一種類似甲基硒代半胱氨酸的有機硒化物從而增加了對高濃度硒的耐受性(Quinnetal., 2010)。這些研究說明，面對植物的硒耐受性，植食性昆蟲也通過各種方式去適應，有的通過改變取食行為，有的則通過把高毒的硒解毒為低毒形式的硒。但目前節肢動物中并未完全闡明硒代謝途徑，已有的研究主要集中于生態學水平，其中硒代謝機制和產物的分析都是基于微生物和哺乳動物硒代謝通路的推測。

在微生物和哺乳動物硒代謝通路中，硒代蛋氨酸(SeMet)通過兩條代謝途徑轉化為硒化物，由胱硫醚γ-裂解酶非特異性地轉化為甲基硒醇(MeSeH)，然后去甲基化為硒化物。甲基硒醇也是由某些植物中含有的甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)通過非特異性β消除而產生的。另一方面，轉硫途徑酶產生硒代半胱氨酸(Sec)，隨后被硒半胱氨酸裂解酶(SCLY)分解為硒化物。硫氧還蛋白(Trx)和硫氧還蛋白還原酶(TrxR)或谷胱甘肽還原酶(GSH)通過中間硒二谷胱甘肽(GSSeGS)可以催化無機亞硒酸鹽還原為硒化物(Cupp-Sutton and Ashby, 2016; Tobe and Mihara, 2018)。而硒化物在硒磷酸合成酶(SPS)的作用下轉化為硒磷酸(SeP)，并在硒代半胱氨酸合酶的作用下結合各種因子合成硒蛋白，進而被生物體所利用(Tobe and Mihara, 2018)。

面對植物的防御體系，植食性昆蟲及害螨在選擇壓力的作用下演化出多種反防御機制以維持種群發展，朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus屬于蛛形綱(Arachnida)真螨總目(Acariformes)葉螨科(Tetranychidae)，在我國分布廣泛，是一種嚴重危害棉花、蔬菜等經濟作物的農業害螨(洪曉月, 2012; van Leeuwenetal., 2012)。本研究所使用的朱砂葉螨對植物的硒耐受性也同樣可以形成適應能力。基于朱砂葉螨普通和硒適應品系，本研究擬分析朱砂葉螨硒通路基因在短期硒處理和長期硒適應中的表達量變化，進而鑒定硒通路響應基因的功能，探究朱砂葉螨對高濃度硒耐受性的分子機制。研究結果不僅可初步明確葉螨適應植物硒耐受性的機制，也可為探索硒對植食性害螨的防控方法提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試蟲

朱砂葉螨普通品系Tc采自重慶北碚田間，一直在室內以珍珠土培育的豇豆Vignaunguiculata隔離飼養。飼養設備為恒溫光照培養箱，溫度控制在26±1℃，相對濕度控制在55%～75%，光周期設定為14L∶10D。

朱砂葉螨長期硒飼養品系(TcSe)為用20 μmol/L亞硒酸鈉(Na2SeO3)溶液和珍珠土培育的豇豆苗長期飼喂(已超過1年)的朱砂葉螨。飼養條件為恒溫光照培養箱，溫度控制在26±1℃，相對濕度控制在55%～75%，光照周期設定為14L∶10D。短期硒處理朱砂葉螨為在0, 5, 20和50 μmol/L亞硒酸鈉(Na2SeO3)處理的豇豆苗上接入200頭朱砂葉螨成螨，處理3 d后采集雌成螨。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

采集1.1節中Tc和TcSe品系的朱砂葉螨雌成螨以及短期硒處理3 d的雌成螨，采用Trizol(Life Technologies)法提取總RNA，150頭朱砂葉螨為一個提取樣本，每個樣本3個生物學重復。選擇OD260/OD280值在1.8～2.0的RNA用RQ1(RNA Qualified)RNase-Free DNase試劑盒(Promega)去基因組進行純化，之后用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 9(TaKaRa)反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.3 朱砂葉螨硒代謝通路基因的克隆與序列分析

通過文獻查找并結合二斑葉螨基因組(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/overview/Tetur)篩選獲得硒代謝通路基因共8條(Tobe and Mihara, 2018)(表1)。使用Primer Premier 5.0軟件設計8條目的基因的全長引物(表1)。以1.2節合成的cDNA為模板進行PCR，擴增體系: 1.1×T3 Super PCR Mix(北京擎科生物公司)2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, Tc品系cDNA 1 μL。擴增條件: 98℃預變性2 min; 98℃變性10 s, Tm±5℃退火10 s, 72℃延伸5～15 s/kb, 33個循環; 72℃加尾2 min。根據已有的核苷酸和氨基酸序列，使用ExPASy-Protparam Tool(http:∥web.expasy.org/protparam/)在線軟件對其基因編碼蛋白質的理化性質(相對分子質量、理論等電點等)進行分析和預測。

表1 引物信息

1.4 qPCR檢測朱砂葉螨硒代謝通路基因表達量

根據1.3節克隆獲得的朱砂葉螨硒代謝通路基因序列，并以TcRPS18為內參基因(Sunetal., 2010)，使用Primer Premier 3.0軟件設計8條目的基因的定量引物并由北京擎科生物公司合成(表1)。以1.2節合成的cDNA為模板進行qPCR，擴增體系: SYBR Green Supermix(Promega公司)10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 7 μL。擴增條件: 預變性95℃ 2 min; 95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 循環40次，每個樣品進行3次生物重復，每個生物重復設置3次技術重復。相對表達量使用2-ΔΔCt方法分析。

1.5 朱砂葉螨SPS1原核表達及分離純化

根據1.3節獲得朱砂葉螨TcSPS1的全長序列，以pET-28b為表達載體(pET-28b載體引物序列：F: 5′-GATGCCATGGGCATGGATATAGATGCATAAT ACTCTTGATTT-3′; R: 5′-CCGCTCGAGGCCTCTCAA TTCGGCAAA-3′)，分別在5′端和3′端引入酶切位點XhoⅠ和NcoⅠ，進行PCR擴增，反應體系同1.3節。PCR產物進行雙酶切(XhoⅠ和NcoⅠ)后使用通用型DNA回收試劑盒DP214(TIANGEN)回收酶切產物，回收后的pET-28b表達載體與目的片段按照試劑盒TreliefTMSoSoo Cloning Kit(北京擎科生物公司)步驟進行同源重組。

將測序正確的重組質粒TcSPS1-pET-28b轉化至表達菌株大腸桿菌EscherichiacoliRosetta(DE3)(北京擎科生物公司)，之后挑選含重組質粒的單菌落至3 mL LB液體培養基中，37℃培養過夜后-20℃保種；取保存于-20℃的菌種100 μL接種于100 mL LB液體培養基中震蕩培養過夜；取10 mL菌液接種于200 mL LB液體培養基中，37℃擴大培養至OD600值約0.6，降低培養溫度到30℃；加入IPTG誘導劑至終濃度0.5 mmol/L，30℃繼續震蕩培養3 h，8 000 r/min離心3 min收集菌體，重懸于50 mL預冷NTA-0緩沖液(pH 8.0)中，冰浴30 min；超聲破碎菌體，參數設置為功率200 W、工作8 s、暫停4 s, 99個循環；16 000 r/min，4℃離心50 min，收集上清以及沉淀進行SDS-PAGE(康為世紀生物科技有限公司)檢測。

根據上一步SDS-PAGE電泳結果，上清中出現目的條帶，則表明存在可溶蛋白，接著采用Ni-NTA SefinoseTMResin Kit(生工生物工程上海股份有限公司)進行親和層析預裝柱來純化重組蛋白上清。首先將預裝柱垂直放置于試驗臺，取下塞子，使保存液自然流出；接著用1個柱體積的Washing Buffer平衡柱子；之后將上述含有重組蛋白的上清液緩緩加入柱中，用3～5個柱體積的Washing Buffer來洗滌柱子；最后，加1柱體積的Elution Buffer來洗脫目的蛋白，并收集純化后的蛋白。

1.6 Western blot檢測

取1.5節中鎳親和層析柱純化后的TcSPS1重組表達蛋白樣品進行SDS-PAGE(康為世紀生物科技有限公司)電泳。按照轉膜操作說明書將SDS-PAGE凝膠上的蛋白通過濕轉的方式轉移到PVDF膜上。從電泳槽中將膜取出，用1×TBST(康為世紀生物科技有限公司)震蕩洗滌3次(每次10 min)，放入事先配好的5%脫脂奶粉(北京索萊寶科技有限公司)中，緩慢震蕩1～2 h進行封閉。事先配制1∶10 000稀釋的His-tag多克隆抗體(康為世紀生物科技有限公司)，將封閉完的PVDF膜(康為世紀生物科技有限公司)用1×TBST清洗3次后，置于一抗中，4℃過夜進行一抗孵育。將過夜孵育后的PVDF膜用1×TBST洗滌3次。加入1∶20 000稀釋的Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗(康為世紀生物科技有限公司)，室溫緩慢搖床1 h，進行二抗孵育。最后將膜用1×TBST洗滌3次；用吸水紙略吸掉過多的液體，平鋪于一次性PE手套上。按照ECL化學發光底物試劑盒(Bio-Rad公司)1∶1(v/v)的比例混勻底物配制顯影液，將顯影液均勻涂在PVDF膜上，避光孵育2 min后，置于全能型凝膠成像系統(Bio-Rad公司)中使目的蛋白顯影，觀察結果并拍照。

1.7 重組蛋白TcSPS1生化特性測定

挑取約200頭3日齡雌成螨，于液氮冷處理的1.5 mL離心管中，加入500 μL 40 mmol/L PBS緩沖液，置于冰上充分研磨，然后以4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。依照Bradford使用的考馬斯亮藍染色法和酶標儀測定粗酶液中酶源蛋白含量(Bradford, 1976)。將1 000 μg/mL的牛血清白蛋白標準溶液用0.5 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)稀釋為5, 10, 20, 40, 60, 80和100 μg/mL 7個濃度梯度。在酶標板中加入上述各濃度梯度的牛血清白蛋白液50 μL，對照為50 μL 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液，再加入考馬斯亮藍G-250溶液200 μL，37℃反應10 min，在595 nm波長下測定其OD值，重復3次實驗。以牛血清白蛋白濃度(μg/mL)為X軸，所測OD值與對照OD值之差(△OD值)為Y軸，得到標準曲線。

參照Ehrenreich等(1992)的方法，使用多功能微孔板分析儀測定TcSPS1的活性。把ATP標準溶液用ATP檢測裂解液稀釋成0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.2和1.6 μmol/L 6個濃度梯度的標準溶液。將100 μL ATP檢測工作液加入檢測孔中，室溫放置3～5 min，用排槍加入上述不同濃度的50 μL ATP標準溶液，迅速混勻，測定其相對光單位(relative light unit, RLU)。在TcSPS1的催化下，底物ATP與硒供體硒化物發生水解反應，生成AMP和SeP(Ehrenreichetal., 1992)。具體操作如下：在無氧條件下將5 μL 0.5 mol/L K3PO4, 5 μL 50 mmol/L醋酸鎂(pH 7.0), 0.2 μL 1 mmol/L Na2SeO3, 10 μL 10 μmol/L ATP, 5 μL 20 mmol/L DTT, 22.3 μL H2O和2.5 μL TcSPS1純化蛋白(對照組為粗酶和水兩組)加入PCR管中，28℃反應30 min，通過檢測ATP的減少量，來反映TcSPS1的酶活性。配制不同濃度梯度的底物(ATP終濃度為0.2～2 μmol/L)，并測定重組蛋白TcSPS1的動力學參數。利用雙倒數作圖法計算出重組蛋白TcSPS1的米氏常數(Km)和最大反應速度(Vmax)。

1.8 數據分析

運用統計軟件SPSS 8.0進行數據分析，其中基因在不同硒濃度處理下的表達量差異顯著性采用單因素方差分析Duncan氏新復極差法進行分析，基因在Tc和TcSe品系之間的表達量差異顯著性采用配對樣本t檢驗進行分析。

2 結果

2.1 基因克隆

成功在朱砂葉螨中克隆得到硒代謝通路上的8條基因(表2)，圖1為TcSPS1的基因序列信息。

圖1 朱砂葉螨TcSPS1基因序列信息

表2 朱砂葉螨8條硒代謝通路基因信息

2.2 硒代謝通路基因表達差異

為了明確硒代謝通路基因的功能，本研究檢測了取食經不同濃度亞硒酸鈉短期處理(處理3 d)的豇豆苗的朱砂葉螨雌成蟲間以及常規豇豆飼養的朱砂葉螨普通品系與長期硒飼養品系雌成蟲間硒代謝通路中8個基因的表達量差異。結果如圖2顯示，朱砂葉螨取食不同濃度亞硒酸鈉短期處理豇豆苗后，硒代謝通路基因中的5條基因的mRNA表達水平發生不同程度的無規律變化，且總體變化幅度不大。其中，只有TcSPS1隨著亞硒酸鈉濃度的增大表達量不斷增多，有明顯的劑量效應。同樣，TcSPS1在長期硒飼養品系中的表達量極顯著高于在普通品系中(P<0.01)，上調表達4.4倍，TcTxnrd1也顯著性上調表達2.2倍(P<0.05)(圖3)。結果表明相對于其他基因，TcSPS1可能在朱砂葉螨硒代謝中起著更重要作用。

圖2 不同亞硒酸鈉濃度短期誘導的朱砂葉螨雌成螨中硒代謝通路基因的相對表達量

圖3 兩種品系朱砂葉螨雌成螨中硒代謝通路基因表達量

2.3 朱砂葉螨TcSPS1基因原核表達和重組蛋白生化特性

TcSPS1重組蛋白以可溶蛋白的形式存在，純化檢測到目的蛋白分子量大約在7 kD，與預測的蛋白分子量6.3 kD相近，Western blot也得到相同結果(圖4)。為了檢測重組蛋白的活性，構建了牛血清白蛋白標準曲線(圖5: A)和ATP標準曲線(圖5: B)，其中：牛血清白蛋白標準曲線的方程為Y=0.0034X+0.1081(R2=0.9770)；ATP標準曲線的方程為Y=6 417 966.2105X+199 782.9860(R2=0.9987)。重組TcSPS1蛋白比活力為2.366±0.046 nmol/mg pro·min，高于粗酶的比活力0.223±0.017 nmol/mg pro·min；動力學參數Km和Vmax值分別為10.054±0.062 μmol/L和29.633±1.777 nmol/mg pro·min。結果表明原核表達獲得了具有硒磷酸合成酶活性的可溶蛋白。

圖4 重組蛋白TcSPS1的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)分析

圖5 牛血清白蛋白(BSA)(A)和ATP(B)標準曲線

3 討論

自然界的硒主要以亞硒酸鹽的形式存在，對亞硒酸鹽代謝和生物利用度的研究主要集中在人類中，目前已被廣泛和成功地用于人類疾病的治療(Meuilletetal., 2004; Mickeetal., 2010; Jirongetal., 2012)。硒也是植物必需的微量元素之一，既可以提高農作物的營養價值，也可幫助植物抵抗害蟲的危害。而植食性害蟲經硒處理后，硒代謝通路基因的表達量上調是降低亞硒酸鈉毒性，提高硒適應能力的關鍵。本研究中朱砂葉螨在不同濃度的硒短期誘導時，TcSPS1,TcSPS2-2,TcPSTK,TcTxnrd1和TcTxnrd2基因的mRNA水平發生了變化(圖2)，表明它們可能與朱砂葉螨對植物硒耐受性的適應性有關。因此我們推測朱砂葉螨取食高毒性的亞硒酸鈉后，亞硒酸鈉被TcTxnrd催化還原為具有較高毒性的硒化物；而硒化物進一步在TcSPS1的催化作用下能夠催化產生一種硒的活化生物形式——硒磷酸；硒磷酸同時在L-Serly-tRNASec, TcPSTK和TcSG的作用下轉化為攜帶硒半胱氨酸的Sec-tRNA，從而生成各類低毒的硒代氨基酸并合成硒蛋白。

但除了TcSPS1以外，其余差異表達的基因在不同高濃度硒誘導下的表達量差異并不大(圖2)，原因可能是這些基因只在朱砂葉螨適應較低硒濃度時發揮作用。而在長期硒飼養品系中，發現TcSPS1和TcTxnrd1顯著上調表達(圖3)，表明TcSPS1和TcTxnrd1與朱砂葉螨對植物硒耐受性的適應力增強有關。且TcSPS1基因在短期硒處理和長期硒適應品系中均上調表達，其表達量與硒處理濃度有一定的相關性，因此我們推測TcSPS1基因在朱砂葉螨對硒的適應過程中起著十分重要的作用。隨后的原核表達實驗通過該酶的專一性底物ATP檢測了朱砂葉螨重組蛋白TcSPS1的比活力，表明朱砂葉螨的TcSPS1能夠催化亞硒酸鈉生成新的硒化合物，證明了TcSPS1基因在硒代謝中有著重要的功能。但在前期哺乳動物的研究中發現只有TcSPS2能夠催化硒化物合成硒磷酸，而TcSPS1可能利用了不同的底物，TcSPS1在生物體內合成硒蛋白中的作用機制并不清楚，這種TcSPS1功能的差異極有可能是螨和哺乳動物之間的物種差異導致的(Xuetal., 2007)。

本研究通過對朱砂葉螨硒代謝通路基因的克隆與分析推測了朱砂葉螨硒代謝通路關鍵基因，并發現多條基因對亞硒酸鈉處理具有響應能力；其中SPS1在短期亞硒酸鈉處理和長期硒飼養品系中均上調表達，且對亞硒酸鈉具有一定劑量效應；進一步通過原核表達獲得了TcSPS1重組蛋白，并測定了其部分生化特性。本研究首次在節肢動物中分析了硒代謝通路基因，并初步解釋了朱砂葉螨對硒的適應的分子機制，研究結果可為節肢動物硒代謝通路的研究以及硒防控害蟲的新技術開發提供一定的理論依據。