原料藥中基因毒性雜質分類清除及控制策略

關元宙，梁毅

（中國藥科大學國際醫藥商學院，南京 211198）

原料藥的生產、運輸及儲存過程中可能引入雜質，這不僅影響藥物純度，還可能引起藥物不良反應，其中基因毒性雜質能以較低水平濃度導致體內DNA受損突變，進而引發癌癥，對患者用藥安全危害大。經過十幾年的發展，藥品監管部門及醫藥行業對藥品中基因毒性雜質的性質、清除及控制均有了新的認知，各國藥品監管部門通報的基因毒性雜質相關藥品召回事件也引起了工業界及大眾對這類雜質的關注?；诂F行ICH 指導原則與行業實施現狀，本文綜合基因毒性雜質特點、分類控制原則、風險評估方法、原料藥生產工藝及質量標準等方面闡述這類雜質的控制策略。

1 原料藥中的基因毒性雜質

原料藥合成過程中使用到多種起始物料、試劑及溶劑，反應過程中還存在副反應及中間體殘留，原料藥分子在運輸儲存過程中還受時間、光照、溫度、pH 值、水、輔料及直接接觸包材的影響而發生降解，以上情況均有可能向原料藥體系引入潛在基因毒性雜質，見圖1。在原料藥雜質譜建立過程中，通常需要對合成路線中原料、中間體、副產物及后續降解產物進行基因毒性分析。常用鑒定雜質具有基因毒性的方法：首先篩選雜質結構，確認存在已知基因毒性雜質相似致突變官能團或經計算機結構毒理學評估程序判定具有基因毒性結構的，再經基因毒性檢測（如Ames 測試）得到陽性結果，有時輔以體內檢測最終確認雜質基因毒性[1]。

圖1 原料藥中基因毒性雜質引入途徑Fig.1 Approaches in genotoxic impurities introducing to drug substances

2 潛在基因毒性化合物相關反應

常見的基因毒性物質具有相似的某幾類官能團，這些官能團常作為警示結構預估雜質是否具有基因毒性。具有警示結構的物質常作為反應物質或反應介質參與原料藥的合成，本文歸納了常見警示結構化合物在原料藥合成過程中為體系引入基因毒性雜質的相關反應，見表1。

表1 警示結構化合物為原料藥引入基因毒性雜質相關反應Tab.1 Structural alerts relevant reactions of genotoxic impurities introducing to drug substances

3 基因毒性雜質分類控制原則及限度要求

3.1 危害性評估

根據雜質的致癌性、基因毒性以及原料藥基因毒性，可將雜質分為5 類（表2）[2]，并給予不同的控制要求（圖2）。當實驗數據證實雜質具有致癌性或基因毒性時，首先考慮清除或避免引入該雜質，實際不可行時則采用可接受標準控制雜質含量，常用有允許日暴露量（Permissible Daily Exposures，PDE）及毒性學關注閾值（Threshold of Concern，TTC）兩種可接受限度計算方法[2]，具體使用見3.2 節。對于無警示結構或警示結構與無基因毒性原料藥一致的雜質，則可按照無基因毒性雜質進行控制。若已知原料藥具有基因毒性，且雜質具有警示結構或確認基因毒性，則可忽略該雜質帶來的致癌風險，也將其列為非基因毒性雜質控制。

表2 基于致癌性及基因毒性歸類的5 類雜質Tab.2 5 tier of impurities classified by carcinogenicity and genotoxicity

圖2 原料藥中基因毒性雜質分類控制路徑圖Fig.2 Control strategies for classified genotoxic impurities in drug substances

3.2 風險表征

1～3 類具有基因毒性的雜質根據可接受攝入量的風險表征原則設計原料藥中雜質可接受限度?？山邮軘z入量是指一個特定的雜質攝入水平，該水平下攝入雜質所增加的致癌風險可忽略不計或低于疾病威脅，若已知雜質的致癌閾值（如1 類雜質及某些3類雜質），可依照該閾值設置PDE，并根據相關治療周期進行調整。若沒有足夠的致癌性數據支持雜質限度的設定，則需要采用保守的致癌性估算方法，即TTC 控制。TTC，指未知致癌或其他毒性作用風險的化學物質的可接受攝入量，其以化學物質作用于最敏感物種及最敏感部位能產生50%腫瘤發生率的濃度（TD50）作為計算基準，線性外推至腫瘤發生率百萬分之一處而得，在藥物研發后期還可將TTC 提高到產生十萬分之一腫瘤發生率的濃度，即1.5 μg/d的限度[3]。若藥物的暴露短于終生時，滿足雜質累計攝入總量不變的前提下還可以放寬其可接受日攝入量，參考表3。

表3 基于TTC 原則及治療周期的單個基因毒性雜質可接受日攝入量Tab.3 Acceptable daily intake of single genotoxic impurity based on TTC approach and treatment period

4 原料藥中基因毒性雜質控制措施

對于基因毒性雜質，總體控制思路是：“避免-清除-控制”[4]，即設計合成路線時避開選用基因毒性物料，調整工藝參數及增加純化手段清除基因毒性雜質，最后開發安全的質量標準及靈敏準確的分析方法以控制殘留的基因毒性雜質[5]。根據基因毒性雜質的特性及引入的工藝位置，確定合適的控制手段，詳見圖3。

圖3 原料藥中基因毒性雜質控制流程圖Fig.3 Scheme of genotoxic impurities controlling in drug substance

4.1 生產工藝優化

4.1.1 合成路線設計

控制原料藥中基因毒性雜質的危害首選措施是避免選用具有基因毒性的原料及試劑，同時選擇無基因毒性雜質生產的合成路線。原料藥合成過程中常用到磷酸酯、鹵代烷烴、烷基磺酸酯、環氧化合物、偶氮、醛類與芳香胺等基因毒性化合物[6-7]，其中烷基磺酸酯類及鹵代烷烴類化合物還可通過多種副反應生成其他基因毒性雜質，所以應盡可能選擇其他化合物代替反應。ICH Q3 規定的1 類溶劑（如：苯、四氯化碳、二氯乙烷）及2 類溶劑（如：氯仿、四氫化萘、己烷、乙二醇）存在致癌風險[8]，可按照Q3 指導原則規定的控制方法避免使用或降低至可接受標準以下。

4.1.2 工藝參數調整

然而許多實際情況導致無法避免基因毒性雜質的引入，一些原料的基因毒性警示結構恰好是合成步驟的活性基團，而在研發后期商業化放大后變更合成路線也不現實，這時則需要優化工藝參數以減少基因毒性雜質的含量。通過適當調整工藝中反應pH值、溫度、時長及反應溶劑的比例等參數，可以改變基因毒性副產物生成反應的反應程度，達到去除基因毒性雜質的效果。如：磺酸酯具有基因毒性，藥物Tasaglitazar[9]生產工藝中使用了芳香類二甲磺酸酯進行醚生成反應，這一步驟向反應體系引入了基因毒性雜質。若將反應pH 值調整為7 并增加回流時間至8 小時，則促進該基因毒性試劑反應完全，反應后期向體系引入水可加速磺酸酯的降解，最終降低雜質殘 留。

4.1.3 原料藥粗品純化

原料藥生產工藝過程中的回流、萃取、活性炭吸附及重結晶等操作本身就具備去除基因毒性雜質的功能，可以根據雜質及原料藥物理化學性質的差異調整參數以清除效率，還可以借助膜過濾、超臨界流體萃取及分子印跡吸附等技術進一步純化原料藥[10]。

4.2 質量控制完善

4.2.1 質量標準制定

基于對當前原料藥整體特性、生產工藝及物料屬性的理解，分析各流程為終產品引入基因毒性雜質的可能性及程度，為雜質檢測部分增加合理的基因毒性雜質限度及開發適當的分析方法[11-12]。如果明確存在前述1～3 類基因毒性雜質，應構建專門的控制策略。在連續6 批中試規?；? 批商業規模的原料藥中基因毒性雜質檢出量低于限度30%的，可將基因毒性雜質檢測列為周期性檢驗項目而不進行常規檢測[2]。

4.2.2 原料及過程控制

結合起始物料生產工藝及原料藥合成路線中雜質的去向，將起始物料、試劑及中間產物中基因毒性雜質含量控制在原料藥限度下，或設置過程控制項目以保證最終產品質量。根據基因毒性雜質引入步驟在工藝中的位置并結合雜質的反應活性、溶解度、解離度及揮發性確定其清除因子，若能合理解釋工藝本身對雜質的清除作用，且能明確雜質最終含量低于可接受標準，可不對該雜質進行質量控制[2]。

5 應用

根據上述原料藥基因毒性雜質清除及控制的原理，可對符合歐洲標準10.0 版的抗敏感類藥物活性成分鹽酸西替利嗪的合成路線及生產工藝過程中可能引入的基因毒性雜質的位置及類型進行分析，并根據基因毒性雜質特性提出相應的控制策略。

5.1 鹽酸西替利嗪合成路線

鹽酸西替利嗪原料藥由起始物料4-氯二苯氯甲烷（化合物A）與N-羥乙基哌嗪（化合物B）在碳酸鈉溶液中進行親核取代反應，得到化合物C，其在堿性條件下與氯乙酸鈉發生取代反應生成化合物D，后者在兩步鹽酸反應下最終生成鹽酸西替利嗪（化合物F）。反應過程中除溶劑水外，還使用了N，N-二甲基甲酰胺（DMF）以及丙酮等有機溶劑作為反應載體。

圖4 鹽酸西替利嗪合成路線Fig.4 Synthesis pathway for cetirizine hydrochloride

5.2 基因毒性雜質篩查

根據基因毒性雜質的來源，結合歐洲藥典標準，從起始物料、中間體、殘留溶劑、副產物及降解產物等方面對該合成路線生產的鹽酸西替利嗪的潛在基因毒性雜質進行分析。

5.2.1 藥典雜質

表4 匯總了歐洲藥典10.0 版中記載的鹽酸西替利嗪生產過程中可能出現的雜質及其可能來源，可將藥典雜質作為成品常規必檢項目，同時根據實際合成路線及工藝條件，增加包括工藝相關的有關物質及殘留溶劑檢測項目。

表4 鹽酸西替利嗪歐洲藥典10.0 版記載雜質信息匯總Tab.4 Information of impurities of cetirizine hydrochloride in European Pharmacopeia 10.0

5.2.2 起始物料及其副產物

該合成路線包含兩個起始物料（化合物A、B），其中化合物A 為鹵代烴，具有基因毒性警示結構，需要納入后期基因毒性雜質控制范疇。而起始物料化合物A 與B 本身均可能攜帶相應雜質，在第一步親核取代反應中起始物料引入的雜質能通過副反應產生雜質A、C、D、E 和F，經過比對，未在這五類雜質中發現基因毒性警示結構，故可按照藥典標準以普通雜質進行控制。

5.2.3 中間體

該合成路線包含三個中間體（化合物C、D、E），三個中間體化學結構均不具有基因毒性警示結構，化合物D 在酸性條件下不穩定，在后續反應中將轉化為化合物E，且化合物E 與成品具有相同化學結構，故可按照藥典標準僅對化合物C 以普通雜質進行控 制。

5.2.4 殘留溶劑及其副產物

該合成路線在第二步親核取代反應中使用到了ICH Q3C 規定[13]的二類溶劑DMF，具有一定的基因毒性，需按照指導原則對其進行中間控制及放行檢查。同時關注DMF 及丙酮在反應過程中產生的潛在基因毒性副產物。如DMF 曾被報道[14]在酸性條件下不穩定，容易生成基因毒性雜質N-二甲基亞硝胺（NDMA）；丙酮在酸性條件下易與自身發生反應（見圖5），產生副產物2，6-二甲基-2，5-庚二烯-4-酮（化合物H）、3-氯-4-甲基-2-戊酮（化合物J）、4-氯，甲基-2-戊酮（化合物K）和2，6-二氯，二甲基-4-庚酮（化合物L），四個副產物分別具有烯酮及鹵代烴等基因毒性警示結構，需要納入基因毒性雜質控制范疇。

圖5 丙醇在酸性條件下所產生的副產物Fig.5 By-products acetone introduced in acid condition

5.2.5 降解產物

成品及雜質G 在存儲運輸過程中容易降解或氧化生成雜質B，因其不具有基因毒性警示結構，故可按照藥典標準以普通雜質對雜質B 進行放行檢測、復驗期檢測及穩定性檢測。

5.3 基因毒性雜質控制

根據上述基因毒性雜質篩查結果，需要按照基因雜質清除及控制策略對起始物料化合物A；殘留溶劑DMF；副產物NDMA 及副產物H～L 等進行嚴格控制。

對于起始物料A，由于其的引入位于四步合成反應的第一步，距離成品鹽酸西替利嗪的成鹽及后續結晶純化步驟較遠，且其低溶解度的性質使其在該步結晶過程中與可溶性中間體C 分離，難以參與后續反應，故可采用中間控制的手段控制其含量。如在第一步親核取代后將其作為雜質項目，控制含量限度在0.1%以下即可保證其后續清除效率，若連續三批驗證批次檢測結果均低于標準30%，也可不納入常規檢驗。

對于殘留溶劑DMF，由于其歸屬于具有基因毒性的二類溶劑范疇，且其在后續反應的酸性條件下不穩定易生成NDMA，故需要在該步驟設置嚴格的中間控制，同時在成品質量標準中進行把關，可根據ICH Q3C 將控制限度設置為8.80×10-4以保證DMF的清除同時預防其在后續酸性反應中生成NDMA。

溶劑丙酮在酸性條件下生成基因毒性副產物H～L，但目前尚未找到合適的替代溶劑，故需要通過工藝參數調整、多步純化以及質量控制等手段保證成品中該類雜質的含量控制在可接受水平之中。副反應效率與保溫回流時間以及反應pH 值相關，可在工藝驗證數據支持下適當縮短保溫回流時間，少量多次加入鹽酸以保持pH 值變化穩定，降低整體副反應效率，減少副產物生成；化合物H～L 具有良好的醇溶性，可利用乙醇對鹽酸西替利嗪粗品進行重結晶純化；同時根據TTC 原則計算雜質限度：目前尚未有文獻記載化合物H～L 的致癌劑量，考慮到鹽酸西替利嗪是過敏患者長期用藥的選擇，劑量為20 mg/ d，以基因毒性雜質可接受日劑量1.5 μg/d 作為計算依據，故基因毒性副產物H～L 的可接受標準應設置為7.5×10-4，質量控制需要開發準確的分析方法，通常使用到HPLC-MS 或LC-MS 等檢測手段。

6 結束語

隨著對原料藥合成過程中基因毒性雜質的引入認知的加深，我國原料藥行業改變了過往對基因毒性雜質控制的“檢出”模式，逐步轉型為“質量源于設計”模式。通過潛在基因毒性雜質危害性評估確定雜質分類及控制策略，進而優化原料藥的合成路線及生產工藝，建立更加合理的質量標準及質量控制體系，從源頭降低原料藥中基因毒性雜質的引入，并通過合適的清除手段降低雜質含量，最終保障用藥安全。然而基因毒性雜質控制仍存在諸多難點，首先要求企業對原料藥合成路徑及反應機理有深刻理解，其次需要建立痕量水平分析方法，最后痕量雜質清除要求采用更先進的純化手法，無疑對我國藥品研發企業提出了新的挑戰。