8種痰液細菌血平板培養菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結果分析

徐杰平 劉雪玲 黃土星 陳龍輝 李秀群 杜青林

清遠市清新區人民醫院，廣東 511800

MPT64是結核分枝桿菌早期生長繁殖過程中大量分泌的一種24 kDa的蛋白質，是結核分枝桿菌復合群的特異性抗原，是目前結核實驗診斷常用的檢測靶標。有研究結果顯示，MPT64對結核分枝桿菌診斷的敏感性和特異性分別為92%和95%，陰性似然比和陽性似然比分別為0.04和25.32，診斷比值比為639.60，受試者工作特征曲線（ROC）下面積（AUC）為0.99［1］。從診斷性試驗的這些評價指標來看，MPT64檢測無疑堪稱結核分枝桿菌診斷的極佳實驗。但是孟繁榮等［2］對痰標本直接進行MPB64檢測的研究結果則對其特異性提出了質疑，其后續的相關研究更是觀察到了金黃色葡萄球菌分泌介質中檢測到MPB64［3］。為全面了解呼吸道感染菌對MPT64檢測的影響，我們對50株痰細菌培養分離株的無菌生理鹽水沖洗液進行了MPT64檢測，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月至2020年12月期間本院呼吸內科、重癥醫學科、康復醫學科、新生兒科、神經內科、冠心病監護病房、心血管內科送檢的痰培養樣本。

1.2 儀器與試劑 細菌分離培養用血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，購自廣州環凱生物技術有限公司。細菌鑒定應用法國梅里埃ATB細菌鑒定系統進行，細菌鑒定用目測鑒定紙條：腸桿菌和其他革蘭陰性桿菌鑒定系統（API 20E），非苛養、非腸道革蘭陰性桿菌鑒定系統（API 20NE），葡萄球菌屬和微球菌屬鑒定系統（API STAPH）。

1.3 細菌培養鑒定方法 主要步驟包括：①接種與培養。挑取膿性、有血部位痰樣本采用分區劃線法接種血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，37℃培養24～48 h；同時挑取同部位的痰樣本涂片染色進行標本是否合格鑒定。②細菌菌屬推斷。結合3種培養基上細菌生長的有無、菌落特征、革蘭染色特征以及G+球菌、G-桿菌等特征性生化反應試驗確定細菌菌屬。③細菌菌種鑒定。應用目測鑒定紙條在法國梅里埃ATB細菌鑒定系統中進行。具體操作嚴格按《全國臨床檢驗操作規程（第4版）》和儀器、試劑說明書進行。

1.4 MPT64檢測方法 主要步驟包括：①菌落沖洗液制備。選取生長旺盛區菌落，無菌吸取滅菌生理鹽水約0.3 ml輕輕沖洗菌落，浸潤3～5 min。②MPT64檢測。無菌吸取菌落沖洗液100μl加入試劑檢測樣本孔，在15～60 min內觀察結果：在檢測線（T）及質控線（C）處均呈現紫紅色條帶者為陽性，只在質控線（C）處呈現紫紅色條帶者為陰性，質控線（C）處不呈現紫紅色條帶者需要重新進行實驗。

1.5 統計學處理 應用Excel 2007收集、整理和分析研究資料，應用頻數分布進行統計學描述。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 合格痰樣本細菌培養分離鑒定情況 共分離培養、鑒定出細菌50株，包括銅綠假單胞菌15株、肺炎克雷伯菌9株、嗜麥芽窄食單胞菌8株、大腸埃希菌8株、金黃色葡萄球菌5株、鮑曼不動桿菌3株、表皮葡萄球菌1株、奇異變形桿菌1株。

2.2 菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結果 在銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌中分別有2、5、4、2株菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性，同時銅綠假單胞菌中有1株呈現可疑陽性結果，具體情況見表1。

表1 痰液細菌血平板培養菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結果

3 討 論

目前，人們已經在細菌中發現了7種不同的分泌系統，將其蛋白質通過多種途徑轉運至菌體細胞之外，分泌的蛋白質可以通過促進細菌毒力、增強對感染細胞的附著、直接中毒靶細胞和破壞其功能方面等機制完成其生理活動與致病過程［4］。其中Ⅶ型分泌系統（typeⅦsecretion system，T7SS）在結核分枝桿菌中被發現，迄今為止的研究表明結核分枝桿菌至少含有5種T7SS（分別命名為ESX-1到ESX-5）［5］。眾所周知，結核分枝桿菌具有十分復雜的細胞壁結構，分枝菌酸與細胞壁基質共價結合，形成了高度疏水、幾乎不通透的分枝菌酸膜，蛋白質必須穿過分枝菌酸膜方能分泌到胞外環境，也許即為結核分枝桿菌擁有強大的T7SS的主要原因。結核分枝桿菌特異蛋白MPT64即經由這些系統分泌到菌體細胞之外，沉積于其生長環境之中，因此人們能夠通過其培養濾液或菌體沖洗液的MTP64檢測鑒定結核分枝桿菌或進行其他功能性試驗（如結核分枝桿菌藥物敏感性試驗）［6-7］。MTP64由結核分枝桿菌RD-2區基因編碼，一般認為是結核分枝桿菌特異性抗原［8］，但本研究發現在銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌和金黃色葡萄球菌的菌落沖洗液中明確檢測到了MTP64的存在，則成為需要深入探究的問題。

從細菌基因組方面看，我們尚未查見這些細菌基因組中有編碼MTP64基因序列的相關報道，加之結核分枝桿菌RD-2區基因的保守特性，我們認為最大的可能是：在這些細菌的分泌物中存在與MTP64抗原特性類似的結構物，導致了檢測方法學上的非特異性。目前人們已經發現在金黃色葡萄球菌、炭疽芽胞桿菌、皮疽諾卡氏菌、枯草芽胞桿菌、產單核細胞增生李斯特菌等細菌中均有T7SS的存在［9-10］，為什么沒有分枝菌酸膜的這些細菌也需要結核分枝桿菌這一特定的分泌系統？或許可以如此推想：它們之所以擁有結核分枝桿菌這一特定的分泌系統，即是因為菌體細胞內有類似結核分枝桿菌蛋白的相關分泌蛋白需要不斷轉運到菌體之外，以實現其生理功能與致病功能。

但是無論如何，本研究的結果直接導致了對應用MPT64檢測鑒定結核分枝桿菌問題的諸多困惑，亟待進行深入的研究，以解決相關的理論和實踐問題。另外，究竟還有哪些細菌也會出現類似的情況，同樣也值得人們進行更為廣泛的探索。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。