金花茶多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其體外抗氧化性

龔 雯 唐 婕 韋雅淵 寧恩創(chuàng) 韋 璐

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530007)

金花茶(CamelliaNitidissimaChi)屬山茶科山茶屬，是國家一級(jí)保護(hù)植物，主要分布于中國廣西壯族自治區(qū)[1]。由于含有特殊的色澤基因KNA，其花瓣呈金黃色半透明狀，被人們譽(yù)為“茶族皇后”“植物界的大熊貓”[2]。金花茶葉含有茶多糖、茶多酚、皂苷、黃酮等功能性成分，具有抗氧化[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、降血壓[6]、護(hù)肝[7]等功能。

多糖(Polysaccharide)是一類對(duì)所有生物體都至關(guān)重要的生物大分子，在結(jié)構(gòu)上由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成[8]。金花茶多糖已被證實(shí)具有保肝[7]、降血脂[9]、抗氧化活性[10]等功能，但有關(guān)金花茶多糖不同分級(jí)的抗氧化性比較與分析尚未見報(bào)道。研究擬采用水提醇沉的方法提取金花茶粗多糖，通過DEAE-陰離子交換法對(duì)金花茶多糖進(jìn)行分級(jí)純化，采用凝膠滲透色譜法(GPC)分析分子量，PMP柱前衍生高效液相色譜法分析單糖構(gòu)成，傅里葉紅外光譜法分析官能團(tuán)，并對(duì)各多糖級(jí)分進(jìn)行體外抗氧化活性分析，旨在為金花茶天然抗氧化劑的開發(fā)利用及金花茶高附加值產(chǎn)品的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金花茶葉干制品：廣西桂人堂金花茶產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；

無水乙醇：分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：分析純，上海麥克林生化試劑有限公司；

雙氧水、過硫酸鉀、抗壞血酸、鄰苯三酚、Tris-HCl：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

DEAE-52纖維素：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:DZF6021型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:EYELA N-3000型，上海亞榮生化儀器廠；

電子天平:TLE204E型，梅特勒—托利多儀器上海有限公司；

數(shù)控超聲波清洗機(jī):JAC-300N型，山東省濟(jì)寧市奧波超聲電氣有限公司；

紫外可見分光光度計(jì):HP-845型，上海儀電分析儀器有限公司；

光柵型多功能微孔板檢測(cè)儀(酶標(biāo)儀):InfiniteM200PRO型，奧地利TECAN公司；

高效液相色譜儀：Waters2969型，安捷倫科技有限公司；

示差折光檢測(cè)器：2414型，美國Waters Corporation公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金花茶粗多糖提取 參照劉茜等[11]的方法并稍作修改。

金花茶葉干制品→剪切碾碎→熱水浸提[料液比(m金花茶葉∶V蒸餾水)1∶55(g/mL)，時(shí)間2.5 h，溫度92 ℃]→旋蒸濃縮(濃縮比10∶1)→醇沉(4倍體積乙醇)→離心→復(fù)溶→Sevage法脫蛋白→聚酰胺樹脂吸附脫色→離心過濾→透析→冷凍干燥→粗多糖

1.3.2 金花茶多糖分離、純化 參照田曉春[12]的方法并稍作修改。配制15 mg/mL的金花茶粗多糖溶液10 mL，離心，取上清液緩慢加入2.6 cm×60 cm的DEAE-52 纖維素層析柱中，按流速15 mL/h，20 min/管，以去離子水、0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的NaCl溶液依次進(jìn)行梯度洗脫。以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，收集濃縮同一峰洗脫液，透析并凍干，獲得多糖組分，按式(1)計(jì)算多糖回收率。

(1)

式中：

c——回收率，%；

m——回收樣品質(zhì)量，mg；

M——上樣量，mg。

1.3.3 多糖組分理化指標(biāo)測(cè)定

(1)總糖含量：采用苯酚硫酸法[13]。

(2)糖醛酸含量：采用咔唑硫酸法[14]。

(3)蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍(lán)法[15]。

(4)多酚含量：采用福林酚法[16]。

(5)還原糖含量：采用DNS法[17]。

1.3.4 金花茶多糖分子量分析 參照邵淑宏[18]的凝膠滲透色譜法(GPC)并稍作修改。超純水配置1 mg/mL多糖溶液，過0.22 μm濾膜后待測(cè)。色譜條件：色譜柱為TSKgel-G400PWXL，RID-10A示差檢測(cè)器，柱溫為常溫，流動(dòng)相為超純水，流速0.5 mL/min。

1.3.5 金花茶多糖單糖組成測(cè)定 參照黃小蘭等[19]的PMP柱前衍生高效液相色譜法并稍作修改。

(1)多糖水解：取金花茶多糖約10 mg，加入2 mol/L的硫酸溶液2 mL，105 ℃水浴6 h，加入4 mol/L的氫氧化鈉溶液2 mL，備用。

(2)衍生化：取單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液、金花茶多糖水解儲(chǔ)備液、單糖混合物標(biāo)準(zhǔn)液各400 μL，加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液200 μL，0.3 mol/L的NaOH溶液200 μL，混勻。70 ℃水浴100 min，冷卻至室溫，添加0.3 mol/L的鹽酸200 μL中和溶液。添加氯仿1 mL，渦旋混勻30 s，靜置，棄下層。反復(fù)萃取3次，取水層溶液過0.22 μm 濾膜，待HPLC進(jìn)樣分析。

(3)色譜條件：色譜柱為VenusilMP-C18，2.1 mm×30 mm，5 μm，采用Agilent 1200色譜系統(tǒng)，測(cè)定波長(zhǎng)250 nm，柱溫30 ℃，流量1 mL/min，流動(dòng)相為0.05 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶—乙腈(V磷酸鹽緩沖液∶V乙腈為83∶17)，樣本數(shù)量15 μL，持續(xù)時(shí)間80 min。

1.3.6 傅里葉紅外光譜 稱取干燥樣品1 mg，加入約100 mg KBr研磨并封閉樣品顆粒，制成透明壓片，于400～4 000 cm-1內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.3.7 金花茶多糖的抗氧化性

(2)

式中：

A0——鄰苯三酚自氧化速率；

AX——加入金花茶多糖后鄰苯三酚自氧化速率。

(2)ABTS+·清除能力：參照文獻(xiàn)[21]。按式(3)計(jì)算ABTS+·清除率。

(3)

式中：

C2——ABTS+·清除率，%；

As——樣品組吸光值；

A0——空白組吸光值。

(3)DPPH·清除能力：參照文獻(xiàn)[21]。按式(4)計(jì)算DPPH·清除率。

(4)

式中：

C3——DPPH·清除率，%；

As——樣品液組吸光值；

Ab——樣品對(duì)照組吸光值；

Ac——空白組吸光值。

(4)·OH清除能力：參照文獻(xiàn)[21]。按式(5)計(jì)算·OH 清除率。

(5)

式中：

C4——DPPH·的清除率，%；

As——添加樣品溶液和水楊酸鈉溶液組的吸光值；

Ab——不添加水楊酸鈉溶液，而用 0.3 mL去離子水取代組的吸光值；

Ac——用去離子水代替樣品溶液組的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 19.0和Origin 10.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花茶多糖的分離純化

以DEAE-52纖維素對(duì)金花茶粗多糖進(jìn)行分離，得到洗脫曲線如圖1所示。將洗脫液中含量較多的多糖分別收集、濃縮、透析、凍干后得到3個(gè)多糖級(jí)分，分別為去離子水洗脫的TPS1、0.2 mol/L NaCl溶液洗脫的TPS2、0.3 mol/L NaCl溶液洗脫的TPS3，測(cè)定其理化指標(biāo)和回收率見表1。由表1可知，各多糖級(jí)分的中性糖和酸性糖含量存在差異：TPS1中中性糖成分較多，TPS2和TPS3中糖醛酸含量較高，且糖醛酸含量TPS3>TPS2。這可能是因?yàn)橄疵撘蝴}濃度越高，得到的多糖酸性強(qiáng)度越強(qiáng)，糖鏈上含有的酸性基團(tuán)如硫酸基、羧基也越多[22-23]。

表1 TPS1、TPS2、TPS3的化學(xué)組成及回收率?

圖1 金花茶粗多糖的洗脫曲線

2.2 金花茶多糖的平均分子質(zhì)量

采用凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)定TPS1、TPS2、TPS3的純度及分子量，用葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品建立的校正曲線方程為：lgMw=-0.008 7t3+0.366 3t2-5.304 6t+31.37，R2=0.999 6。由圖2可知，TPS1是由兩個(gè)不同分子量(1.55×105，1.05×104Da)的組分構(gòu)成的混合多糖，TPS2和TPS3為均一組分，分子量分別為4.21×105，6.67×105Da。

圖2 TPS1、TPS2和TPS3的GPC分析圖譜

2.3 金花茶多糖的單糖構(gòu)成

采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測(cè)得TPS1、TPS2和TPS3的單糖構(gòu)成如表2所示，圖3為8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合的PMP衍生物及3種金花茶多糖的HPLC圖譜。由表2、圖3可知，3種金花茶多糖級(jí)分的單糖種類及比例存在差異：TPS1主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖構(gòu)成，且未檢出葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸成分；TPS2與TPS3主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖構(gòu)成，TPS3中半乳糖醛酸摩爾百分比高于TPS2。

1.甘露糖 2.核糖 3.鼠李糖 4.葡萄糖醛酸 5.半乳糖醛酸 6.葡萄糖 7.半乳糖 8.阿拉伯糖

表2 TPS1、TPS2、TPS3的單糖組成

2.4 金花茶多糖的傅里葉紅外光譜

圖4 TPS1、TPS2和TPS3的紅外光譜圖

2.5 金花茶多糖的抗氧化性

圖5 樣品對(duì)的清除率

2.5.2 ABTS+·清除能力 由圖6可知，TPS1、TPS2和TPS3對(duì)ABTS+·具有一定的清除能力，且呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，TPS1、TPS2、TPS3和維生素C對(duì)ABTS+·的清除率分別為42.31%，62.27%，69.96%，94.79%，對(duì)ABTS+·清除能力的IC50值依次為TPS1(1.742 mg/mL)>TPS2(0.749 mg/mL)>TPS3(0.534 mg/mL)>維生素C(0.018 mg/mL)。葉潤等[29]研究發(fā)現(xiàn)，油菜葉多糖對(duì)ABTS+·清除能力的IC50值為1.63 mg/mL；岳崢嶸等[30]研究發(fā)現(xiàn)，鉚釘菇多糖對(duì)ABTS+·清除能力的IC50值為10.28 mg/mL。綜上，金花茶多糖具有一定的ABTS+·清除能力，其中TPS3的最佳。

圖6 樣品對(duì)ABTS+·的清除率

2.5.3 DPPH·清除能力 由圖7可知，TPS1、TPS2和TPS3對(duì)DPPH·具有較好的清除能力，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，TPS1、TPS2、TPS3和維生素C對(duì)DPPH·清除率分別為44.30%，65.10%，71.95%，99.90%，對(duì)DPPH·清除能力的IC50值依次為TPS1(1.748 mg/mL)>TPS2(0.725 mg/mL)>TPS3(0.557 mg/mL)>維生素C(0.006 mg/mL)。陳浩[31]研究表明普洱茶多糖對(duì)DPPH·清除能力的IC50值為1.45 mg/mL；張陽等[32]研究發(fā)現(xiàn)，南酸棗多糖對(duì)DPPH·清除能力的IC50值為3.08 mg/mL。綜上，金花茶多糖具有較好的DPPH·清除能力，其中TPS3的最佳。

圖7 樣品對(duì)DPPH·的清除率

2.5.4 ·OH的清除能力 由圖8可知，TPS1、TPS2和TPS3具有較好的·OH清除能力，且呈明顯的量效關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，TPS1、TPS2、TPS3和維生素C對(duì)·OH的清除率分別為56.15%，77.28%，84.56%，89.40%，對(duì)·OH清除能力的IC50值依次為TPS1(0.989 mg/mL)>TPS2(0.583 mg/mL)>TPS3(0.233 mg/mL)>維生素C(0.012 mg/mL)。石玉濤[33]研究發(fā)現(xiàn)，·OH清除率最高的茶多糖其IC50值為1.14 mg/mL；熊磊等[34]研究發(fā)現(xiàn)黃金茶多糖對(duì)·OH清除能力的IC50值為1.713 mg/mL。綜上，金花茶多糖具有較強(qiáng)的·OH清除作用，且TPS3較TPS2和TPS1具有更強(qiáng)的清除能力。

圖8 樣品對(duì)·OH的清除率

TPS1、TPS2和TPS3均具有一定的抗氧化性，但較陽性對(duì)照維生素C組存在一定差距，而這種差距來源于維生素C和多糖提供氫質(zhì)體及接收電子程度的難易程度[35]。3種金花茶多糖級(jí)分TPS1、TPS2和TPS3的抗氧化性各不相同，抗氧化性TPS1

3 結(jié)論