酶解馬鮫魚下腳料制備海鮮醬工藝優化

鄭瑞生 林雅萍 孫秋瓊 張冰泉 鄭宗平

(1.泉州師范學院海洋與食品學院，福建 泉州 362002；2.安記食品股份有限公司，福建 泉州 362001；3.中紡檢測〔福建〕有限公司，福建 泉州 362002)

馬鮫魚為暖水性中上層低值魚，肉質細膩、味道鮮美，具有較高的營養價值[1]。中國福建馬鮫魚資源豐富，且馬鮫魚加工企業繁多，加工產品有馬鮫魚卷、馬鮫魚羹等。僅福建省惠安縣某食品企業馬鮫魚年加工量近1 800 t，加工過程中會產生大量的下腳料(魚皮、魚骨、魚頭等)，占全魚總質量的45%～55%。這些下腳料中含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、多糖、礦物質、生物活性肽等[2]，目前僅作為制備動物飼料之用[3]，附加值低。

近年來，越來越多的人開始關注馬鮫魚下腳料的綜合開發利用，如：萃取魚油[4]，提取蛋白酶解產物中的呈味物質[5]，提取魚皮膠原蛋白[6]，提取抗氧化肽[7]等，也有利用馬鮫魚魚頭制備寵物犬餅干[8]，以及快速預測馬鮫魚貨架期[9]的相關報道。但未見利用馬鮫魚下腳料制備海鮮醬的相關研究報道。

海鮮醬是以蝦、魚、貝、藻等海洋生物或其下腳料為原料，經腌制、發酵等工藝制成的一種風味典型、營養豐富的醬類風味調味品。目前中國海鮮醬制品多以傳統的自然發酵工藝為主，所制得的海鮮醬制品組織細膩，風味較好，營養豐富。但在生產過程中極易受微生物污染，且生產周期長，品質不穩定[10]。試驗擬以馬鮫魚下腳料為原料，研究不同酶解工藝對提高馬鮫魚下腳料蛋白水解度及氨基酸態氮含量的影響，并利用下腳料酶解液制備具有特殊風味的海鮮調味醬，以期為馬鮫魚下腳料的再利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鮫魚下腳料：主要為馬鮫魚魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、內臟等，惠安瑞芳食品有限公司；

風味蛋白酶(酶活12.9萬U/g)、木瓜蛋白酶(酶活4.2萬U/g)、中性蛋白酶(酶活23.5萬U/g)、復合蛋白酶(酶活11.1萬U/g)、堿性蛋白酶(酶活22.3萬U/g)：廣西龐博生物工程公司；

硫酸銅：分析純，沈陽新西試劑廠；

氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸鉀、硼酸：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；

鹽酸、甲醛：優級純，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平：BS124S型，北京賽多利斯儀器系統有限公司；

鼓風干燥箱：BGZ-146型，上海博迅實業有限公司；

高壓滅菌鍋：YXQ-LS-70A型，上海博迅實業有限公司；

自動凱氏定氮儀：K9840型，濟南海能儀器股份有限公司；

均質機：T-18型，德國IKA儀器設備有限公司；

高速打漿機：18型，邢臺裕隆機械廠；

索氏抽提器：SXT-06型，上海洪記儀器設備有限公司；

精密pH計：PHS-3C型，上海雷磁儀器有限公司。

1.3 馬鮫魚下腳料及酶解液各項指標的檢測

1.3.1 水分 按GB 5009.3—2016執行。

1.3.2 蛋白質及總氮 按GB 5009.5—2016執行。

1.3.3 氨基酸態氮 按GB 5009.235—2016執行。

1.3.4 粗脂肪 按GB 5009.6—2016執行。

1.3.5 水解度的測定 參照文獻[11]。

(1)

式中：

D——水解度，%；

AN——酶解液中氨基酸態氮質量濃度，g/100 mL；

TN——酶解液中總氮質量濃度，g/100 mL。

1.4 馬鮫魚下腳料酶解工藝研究

1.4.1 工藝流程

馬鮫魚下腳料→除雜→攪碎→調節液料比→酶解→過濾→均質→4 ℃冷藏備用

1.4.2 操作要點

(1)馬鮫魚下腳料采集：主要為馬鮫魚魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、內臟等，-20 ℃隔夜冷凍后裝入泡沫保溫箱運輸至海洋與食品學院實驗室，-20 ℃凍藏備用。

(2)除雜、攪碎：將馬鮫魚下腳料(魚皮、魚頭、魚尾、魚鰭、內臟)去除雜質，混合放入打漿機中進行絞碎，取出，分裝后放入-20 ℃冷凍備用。

(3)酶解：取馬鮫魚下腳料500 g，設定不同的蛋白酶種類、酶解時間、液料比、溫度、pH、加酶量6個因素，進行馬鮫魚下腳料的酶解試驗。

(4)過濾：酶解液過100目濾篩，去除多余雜質。

(5)均質：利用T18型IKA均質機對濃縮酶解液進行處理，每均質30 s暫停5 s，持續5 min。

1.4.3 酶解工藝優化

(1)蛋白酶種類對酶解效果的影響：選擇風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶，在加酶量2 000 U/g、液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、酶解時間4 h，以及各自適宜pH和溫度下進行酶解，以氨基酸態氮含量、感官及使用成本等為評價指標，篩選適宜的蛋白酶。

(2)液料比對酶解效果的影響：分別設置液料比(V水∶m下腳料)為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1(mL/g)，在酶解時間4 h、加酶量2 000 U/g、酶解溫度50 ℃、pH 7.0 條件下進行酶解，以氨基酸態氮含量及水解度為評價指標，篩選適宜的液料比。

(3)加酶量對酶解效果的影響：分別設置加酶量為0，500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 U/g，在酶解時間4 h、液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、酶解溫度50 ℃、pH 7.0條件下進行酶解。以氨基酸態氮含量及水解度為評價指標，篩選適宜的酶添加量。

(4)酶解溫度對酶解效果的影響：分別設置酶解溫度為40，45，50，55，60 ℃，在加酶量2 000 U/g、液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、pH 7.0、酶解時間4 h條件下進行酶解，以氨基酸態氮含量及水解度為評價指標，篩選適宜的酶解溫度。

(5)酶解時間對酶解效果的影響:分別設置酶解時間為1，2，3，4，5，6 h，在液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、加酶量2 000 U/g、酶解溫度50 ℃、pH 7.0條件下進行酶解，以氨基酸態氮含量及水解度為評價指標，篩選適宜的酶解時間。

(6)pH對酶解效果的影響：分別設置pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，在液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、加酶量2 000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h條件下，以氨基酸態氮含量及水解度為評價指標，篩選適宜的pH。

(7)正交試驗：根據單因素試驗的結果，選取影響較為顯著的液料比、酶解時間、pH和酶解溫度4個因素進行L9(34)正交試驗設計，以氨基酸態氮含量為指標，確定最佳的酶解工藝條件。

1.5 馬鮫魚下腳料酶解液海鮮醬的制備

1.5.1 工藝流程

馬鮫魚下腳料酶解液→調味→加熱→均質→排氣→裝罐→封口→滅菌→冷卻→成品檢驗

1.5.2 操作要點

(1)原輔料的調味：利用酶解液進一步開發海鮮醬，經過前期調味試驗，確定最終配方原輔料添加量為酶解液80%～85%、鹽5%～8%、糖2%～3%、咖喱粉1%～3%、姜汁1%～2%、老抽0.5%～1.0%、花椒0.03%～0.05%、黃原膠0.5%～1.0%。

(2)加熱：將馬鮫魚下腳料酶解液倒入鍋中，依次加入鹽、咖喱粉、姜汁、花椒油、料酒、糖與黃原膠混合物，攪拌均勻，加熱至85～100 ℃，熬制5～10 min，使海鮮醬形成黏稠狀即可。

(3)均質：均質壓力0.25 MPa，均質2次。

(4)裝罐、密封：將熬制好的海鮮醬趁熱灌裝，溫度控制在70 ℃以上。

(5)滅菌、冷卻：121 ℃下滅菌15 min，用自來水冷卻至室溫，常溫貯藏。

1.5.3 感官評價 選擇10名經專業培訓的人員，根據表1 感官評價標準對海鮮醬產品進行評價[12]。

表1 海鮮醬的感官評價標準

1.5.4 理化、微生物及營養指標檢測 由福建中紡檢測有限公司檢測。各項指標進行雙平行試驗，使用SPSS 24.0軟件進行正交統計分析、使用LSD(最小顯著法)進行顯著性差異分析；利用Excel統計軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 馬鮫魚下腳料主要營養成分

馬鮫魚下腳料中粗脂肪[(8.26±0.46)%]、蛋白質[(14.46±0.87)%]、氨基酸態氮[(0.515±0.048)%]質量分數較高，水分質量分數為(65.90±0.44)%，具有較高的營養價值和經濟價值，可作為海鮮醬的原料進行開發利用。

2.2 馬鮫魚下腳料酶解工藝優化

2.2.1 蛋白酶種類對酶解效果的影響 由表2可知，幾種蛋白酶對馬鮫魚下腳料進行酶解，氨基酸態氮含量從高到低依次為：風味蛋白酶>中性蛋白酶>復合蛋白酶>堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶。感官方面，中性蛋白酶和風味蛋白酶酶解液的腥味較弱，復合蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的異味較重。成本方面，中性蛋白酶的最低，而酶解效果較好的風味蛋白酶使用成本是中性蛋白酶的1.82倍。中性蛋白酶屬于內切酶，可水解Tyr、Phe等疏水性氨基酸殘基的羧基端肽鍵，有利于其他蛋白酶發揮外切作用，改善產物的口感[13]，廣泛應用于動植物蛋白的水解，生產高級調味品和食品營養強化劑等。風味蛋白酶具有內切蛋白酶和外切肽酶兩種活性，并能將多肽鏈的末端和內部的肽鍵水解，但易受鉛、銅、汞、砷等重金屬離子和氧化劑的抑制及破壞[14]。海魚下腳料中常帶有一定鉛、汞、砷等重金屬，抑制了風味蛋白酶的活性[15]。而堿性蛋白酶屬于一種絲氨酸胞外高堿性蛋白酶，具有較強的分解蛋白質的能力[16]，在一些水產資源上明顯具有優越性。但從酶活力角度而言，中性蛋白酶和堿性蛋白酶要遠勝于其他幾種酶。綜合評價氨基酸態氮含量、感官評價、酶活力以及使用成本等指標，最終選用中性蛋白酶用于后期酶解試驗。

表2 不同蛋白酶的酶解效果

2.2.2 液料比對酶解效果的影響 如圖1所示，隨著液料比的不斷增加，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態氮質量濃度呈下降趨勢，且差異達到極顯著水平(P<0.01)。但水解度卻呈先升高后降低趨勢，當液料比(V水∶m下腳料)為3∶1(mL/g)時，酶解液的水解度達到最大值(30.43±1.56)%，此時酶與底物反應最為充分。擬選擇液料比(V水∶m下腳料)3∶1(mL/g)進行后期酶解試驗。

同指標字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.3 加酶量對酶解效果的影響 如圖2所示，隨著加酶量的不斷增加，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態氮質量濃度及水解度均呈上升趨勢，但添加500～3 000 U/g中性蛋白酶的酶解效果差異不顯著(P>0.05)。這可能是因為馬鮫魚下腳料自身存在一定的內源酶，且底物量固定，添加過多的外源酶并不能明顯改善其酶解效果。考慮酶解效果及使用成本，擬選擇加酶量500 U/g進行后期酶解試驗。

同指標字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.4 酶解溫度對酶解效果的影響 如圖3所示，隨著酶解溫度升高，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態氮質量濃度及水解度均呈先上升后下降的趨勢，差異達到極顯著水平(P<0.01)。中性蛋白酶是一種內切酶，最適溫度范圍在45～60 ℃，最適溫度或因作用底物的不同略有差異。當酶解溫度為55 ℃時，中性蛋白酶作用于馬鮫魚下腳料分解產生的氨基酸態氮量及水解度最高。姜淼等[17]也研究發現57 ℃更有利于中性蛋白酶應用于海參調味料的脫腥。因此，擬選擇酶解溫度55 ℃進行后期酶解試驗。

同指標字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.5 酶解時間對酶解效果的影響 如圖4所示，隨著酶解時間的不斷延長，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態氮質量濃度及水解度也不斷增加。當酶解4 h時氨基酸態氮質量濃度、水解度分別達到(0.294±0.002)g/100 mL，(33.99±0.29)%之后趨于平穩，與酶解5～6 h差異不顯著(P<0.05)。這是由于隨著酶解時間的延長，酶與底物充分反應，氨基酸態氮質量濃度及水解度增加。但反應時間過長時，底物濃度降低，酶活力下降，導致氨基酸態氮質量濃度及水解度趨于穩定狀態。因此，擬選擇酶解時間4 h進行后期酶解試驗。

同指標字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.6 pH對酶解效果的影響 如圖5所示，隨pH升高，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態氮質量濃度及水解度呈先上升后下降趨勢，差異達到極顯著性(P<0.01)。pH為7.0時氨基酸態氮質量濃度及水解度達到最高值。由于采用的是中性蛋白酶，其最佳pH在6.0～7.5。因此，選擇pH 7.0進行后期酶解試驗。

同指標字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.7 正交試驗 利用中性蛋白酶，在加酶量500 U/g的條件下，選取影響顯著的酶解溫度、酶解pH、液料比和酶解時間進行四因素三水平正交試驗，正交試驗設計及結果見表3～表5。

表3 正交試驗因素和水平

由表4可知，酶解的最優組合為A2B3C1D3，即酶解溫度55 ℃，pH 7.5，液料比(V水∶m下腳料)3∶1(mL/g)，酶解時間5 h。通過方差分析(表5)可知，馬鮫魚下腳料酶解效果影響因素依次為：液料比>酶解溫度>pH>酶解時間，4個因素對氨基酸態氮含量差異達到極顯著水平(P<0.01)。通過對A2B3C1D3的最優組合進行3次重復驗證實驗，結果表明，酶解馬鮫魚下腳料的氨基酸態氮平均質量濃度高達(0.325±0.004)g/100 mL，高于表4中的任一組合，表明優選的工藝穩定可行。

表4 酶解工藝條件正交試驗設計及極差分析結果

表5 正交試驗設計方差分析表

2.3 馬鮫魚下腳料酶解液海鮮醬品質分析

2.3.1 感官品質 由10名品評人員對市售海鮮醬(對照組)與馬鮫魚下腳料酶解液制備的海鮮醬進行感官評價。對兩款產品打亂順序進行盲評，由品評人員對其進行打分。由表6可知，馬鮫魚下腳料酶解液制備的海鮮醬無論從色澤、風味、形態、質地均優于市售海鮮醬，綜合感官評分也高于市售海鮮醬，差異達到顯著水平(P<0.05)。由此可見，自制海鮮醬制品已達到甚至超過市售海鮮醬的口感，符合消費者口味需求。

表6 海鮮醬的感官評價?

2.3.2 理化、微生物及營養指標 將馬鮫魚下腳料酶解液制備的海鮮醬送第三方機構進行檢測，檢測結果見表7～表9。由表7～表9可知，自制海鮮醬所檢測理化及微生物指標均符合國家相關標準[18]要求。

表7 海鮮醬主要理化指標

表8 海鮮醬微生物指標

表9 海鮮醬營養成分表

3 結論

為充分利用馬鮫魚下腳料，減少資源浪費及降低環境污染，利用馬鮫魚下腳料制備海鮮醬。馬鮫魚下腳料的最佳酶解工藝條件為：采用中性蛋白酶，加酶量500 U/g，液料比(V水∶m下腳料)3∶1(mL/g)，酶解溫度55 ℃，pH值7.5，酶解時間5 h。該條件下，酶解液的氨基酸態氮質量濃度高達(0.325±0.004)g/100 mL。以其制備的海鮮醬與市售海鮮醬的感官品質相當。為更加安全有效的利用馬鮫魚下腳料，后續將重點研究下腳料有害物質的檢測與去除方法，為馬鮫魚下腳料加工再利用提供安全技術保障。