超聲波輔助提取柚樹葉黃酮及其抗氧化、抑菌能力研究

丘苑新 張澤雄 何 娣 蔡健常 柳建良

(仲愷農業工程學院現代農業工程創新研究院，廣東 廣州 510225)

柚子[Citrusmaxima(Burm)Merr.]屬于蕓香科柑橘屬，有著“天然水果罐頭”之美譽[1]，其氣味芬芳，口感酸甜，具有極高的營養及藥用價值[2]。柚樹葉富含精油、黃酮等物質，其中黃酮類化合物具有抑制多種細菌、真菌、病原體等致病微生物的作用，還具有抗腫瘤的作用，被廣泛應用于臨床上[3-4]。此外，黃酮類化合物還能與其他藥物、維生素等復配發揮協同作用，顯著提高其生物活性[5]。常見的黃酮提取方法有超聲波輔助提取法[6]、超臨界提取法[7]、有機溶劑提取法[8]、微波輔助提取法[9]及堿提酸沉法[10]。超聲輔助提取法是一種高效、環保的提取技術，常用于提取熱不穩定性的成分[11]，周旋等[12]通過超聲輔助法提取女貞子總黃酮并進行抗氧化活性研究；Luis等[13]采用超聲輔助提取藤黃總黃酮并將其提取率提高了3倍以上。目前，有關柚樹葉的研究主要集中在精油的提取方面，如郭剛軍等[14]運用超臨界萃取柚樹葉精油并進行GC-MS分析；黃桂平等[15]采用微波輻射法提取柚樹葉香精油，其得率達1.03%；Tan等[16]通過微波輔助水解法提取柚樹葉精油，并采用響應面法進行工藝優化。而關于柚樹葉黃酮的報道較少，如周夢春等[17]僅對柚樹葉黃酮含量進行了測定，但并未進行提取工藝優化與抗氧化、抑菌性能研究。研究擬以柚樹葉為原料，通過超聲輔助法提取總黃酮，優化其工藝條件，并對提取物的抗氧化和抑菌能力進行探索，以期為更全面地開發利用柚樹葉黃酮提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮柚樹葉：采自廣東梅州市；

蘆丁標準品、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液(pH 6.82)：分析純，上海源葉生物技術有限公司；

無水乙醇、石油醚、氯化鋁、氯化鐵：分析純，廣州化學試劑廠；

三氯乙酸：分析純，天津市百世化工有限公司；

亞硝酸鈉：分析純，天津市永大化學試劑有限公司；

抗壞血酸：分析純，廣東光華科技股份有限公司；

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌：仲愷農業工程學院微生物實驗室；

超聲波清洗機：YL-040S型，深圳市聚眾發商貿有限公司；

旋轉蒸發儀：：RV10型，武漢集思儀器設備有限公司；

生化培養箱：SPX-150型，上海悅豐儀器儀表有限公司；

低速離心機：SC-3610型，安徽中科中佳科學儀器有限公司；

分光光度計：UV-1800PC型，太原衡天力科貿有限公司；

高壓滅菌鍋：YXQ-LS-50SII型，上海博訊實業有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 柚樹葉總黃酮提取工藝流程

柚樹葉清洗→65 ℃烘干至恒重→粉碎→取2.0 g樣品用乙醇浸提總黃酮(40 ℃、功率240 W)→減壓抽濾→離心(5 000 r/min、10 min)→測定上清液吸光度(510 nm)→石油醚脫脂、脫色→旋轉蒸發(50 ℃)→冷凍干燥

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制 根據文獻[18]并修改：精確稱取2.5 mg蘆丁標準品溶于25 mL體積分數為90%乙醇溶液中，制得0.1 mg/mL的蘆丁儲備液。分別吸取蘆丁儲備液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL質量分數為5%的NaNO2溶液搖勻并靜置6 min；加入0.3 mL質量分數為5%的Al(NO3)3溶液搖勻并靜置6 min；加入4.0 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液并用體積分數為30%乙醇溶液定容，搖勻，靜置15 min。以未加蘆丁標準液的反應溶液作為參比溶液，測定510 nm處吸光度；以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得y=15.160x+0.006，R2=0.999 8。

1.2.3 柚樹葉總黃酮提取量的測定 精確吸取1 mL柚樹葉提取液，按式(1)計算總黃酮提取量。

(1)

式中：

g——總黃酮提取量，mg/g；

c——總黃酮質量濃度，mg/mL；

n——稀釋倍數；

m——柚樹葉干粉質量，g。

1.2.4 單因素試驗

(1)乙醇體積分數：固定提取時間40 min、料液比(m柚樹葉∶V乙醇)1∶20(g/mL)，探究乙醇體積分數(50%，60%，70%，80%，90%)對總黃酮提取量的影響。

(2)提取時間：固定乙醇體積分數60%、料液比(m柚樹葉∶V乙醇)1∶20(g/mL)，探究提取時間(20，30，40，50，60 min)對總黃酮提取量的影響。

(3)料液比：固定乙醇體積分數60%、提取時間40 min，探究料液比[1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30(g/mL)]對總黃酮提取量的影響。

1.2.5 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選取提取時間、乙醇體積分數和料液比為因素進行正交試驗設計，以確定柚樹葉黃酮的最佳提取工藝。

1.2.6 抗氧化能力

(1)樣品制備：取最優提取工藝下的提取液，加入25 mL 石油醚重復萃取3次，以除掉色素與脂溶性物質，旋轉蒸發以除掉乙醇和石油醚，冷凍干燥得黃酮類化合物干粉。用體積分數為30%乙醇溶解提純后的黃酮類化合物干粉，配制成黃酮類化合物質量濃度為0.147 mg/mL的溶液，同時配制總黃酮質量濃度為0.147 mg/mL未除雜的提取液與0.147 mg/mL的抗壞血酸溶液作為對照。

(2)總還原力測定：根據文獻[19]并修改。分別吸取樣品液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于15 mL離心管中，用蒸餾水將各離心管液體補足至1 mL，復配溶液中黃酮質量濃度依次為0.000，0.029，0.059，0.088，0.118，0.147 mg/mL，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.82)2.5 mL，搖勻，加入質量分數為1%的K3[Fe(CN)6]溶液2.5 mL，搖勻，50 ℃水浴20 min，加入體積分數為10%的CCl3COOH溶液2.5 mL，3 000 r/min離心10 min。分別取離心后上清液2.5 mL于10 mL試管中，加入質量分數為0.1%的FeCl3溶液0.5 mL，定容至10 mL，搖勻，靜置15 min。以未加樣品液的反應溶液作為參比溶液，測定700 nm處吸光度。

1.2.7 抑菌能力

(1)柚樹葉提取液的制備：取除色脫脂后的黃酮類化合物干粉，用體積分數為30%乙醇溶解，配成黃酮類化合物質量濃度為0.147 mg/mL，同時配制總黃酮質量濃度為0.147 mg/mL的未除雜提取液作為對照。

(2)菌懸液制備：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌經兩次活化，菌液用生理鹽水稀釋，于血球計數板計數，選取菌液濃度為(1×106～4×106CFU/mL，接種時，將菌液濃度稀釋至106CFU/mL。

(3)抑菌圈測定：采用牛津杯法[20]。以體積分數30%乙醇為空白對照，青霉素為陽性對照。

(4)最低抑菌濃度：采用二倍稀釋法[21]，將柚樹葉黃酮類化合物提取液用體積分數30%乙醇稀釋為原液的100.0%，50.0%，25.0%，12.5% 4個濃度，觀察各提取液濃度下的培養皿是否出現抑菌圈。

1.3 數據處理

運用SPSS 25.0、Origin 9.5軟件進行數據處理及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對柚樹葉黃酮提取量的影響 由圖1 可知，柚樹葉總黃酮提取量隨乙醇體積分數的增加呈先升高后降低趨勢，最高達到10.24 mg/g。當乙醇體積分數為50%～80%時，柚樹葉總黃酮提取量逐漸升高，可能是隨著乙醇體積分數的增加，醇溶性黃酮類化合物加速溶解[22]。繼續增大乙醇體積分數，總黃酮提取量減小，說明乙醇體積分數較大時，溶劑的極性降低，大量的脂溶性和醇溶性成分溶出，黃酮類化合物溶解度降低，從而導致總黃酮提取量減小[23]。因此，提取柚樹葉總黃酮的乙醇體積分數以80%為宜。

圖1 乙醇體積分數對黃酮提取量的影響

2.1.2 提取時間對柚樹葉黃酮提取量的影響 由圖2可知，總黃酮提取量隨提取時間的延長先增加后減少。當提取時間為20～50 min時，柚樹葉細胞壁逐漸被破壞，黃酮類物質在超聲波作用下不斷溶出并在50 min時全部溶出，故總黃酮提取量逐漸增加[24]；若繼續延長提取時間，長時間的超聲會使黃酮結構發生破壞或者發生降解使提取率下降[25]。因此，提取柚樹葉總黃酮的提取時間以50 min 為宜。

圖2 提取時間對黃酮提取量的影響

2.1.3 料液比對柚樹葉黃酮提取量的影響 由圖3可知，隨著料液比的增加，總黃酮提取量不斷升高。隨著溶劑的增加，柚樹葉粉末與溶液更加充分接觸，黃酮析出速率加快，黃酮提取量逐漸升高；當料液比(m柚樹葉∶V乙醇)<1∶20(g/mL)時，黃酮提取量顯著提高；當料液比(m柚樹葉∶V乙醇)>1∶20(g/mL)時，黃酮提取量不僅增加緩慢，而且會大大增加提取成本[26]。因此，最佳的料液比(m柚樹葉∶V乙醇)為1∶20(g/mL)。

圖3 料液比對黃酮提取量的影響

2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取乙醇體積分數、提取時間和料液比為因素，總黃酮提取量為響應值進行三因素三水平正交試驗設計。因素水平表見表1，正交試驗設計與結果見表2。

表1 因素水平表

由表2可知，柚樹葉總黃酮提取量的主次因素為乙醇體積分數>提取時間>料液比，最佳提取條件為A3B3C2，即乙醇體積分數80%、提取時間50 min、料液比(m柚樹葉∶V乙醇)1∶25(g/mL)。最佳提取條件下進行3次平行試驗，測得總黃酮提取量平均值為11.746 mg/g，高于正交試驗中的任一結果，符合最優條件，表明正交試驗得出的最佳工藝結果具有可靠性。

表2 柚樹葉總黃酮提取正交試驗設計與結果

2.3 抗氧化能力

由圖4可知，隨著樣品液質量濃度的升高，其總還原能力逐漸增強，證明該抗氧化活性的樣品與其添加量有良好的量效關系。未除雜的提取液總還原力約是初步除雜樣品液的50%，當樣品質量濃度>0.088 mg/mL時，抗氧化活性隨樣品質量濃度的增加逐漸趨于平緩，可能是未除雜的提取液中含有色素及脂類的干擾，降低了其抗氧化活性。而除去色素與脂類的樣品液，其總還原力略高于抗壞血酸，約是同等質量濃度抗壞血酸的1.25倍。初步除雜后的提取液在高濃度時依然能保持較好的還原能力，若進一步提純柚樹葉黃酮類化合物，其抗氧化能力將會更強。

圖4 總還原力測定結果

2.4 抑菌能力

由表3可知，柚樹葉黃酮類化合物提取液在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的培養基中均出現了抑菌圈，其對3種菌有一定的生長抑制作用。未經除雜的提取液抑菌效果較差，金黃色葡萄球菌表現為中度敏感、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌表現為低度敏感，但有抑菌圈出現，說明仍有一定抑菌效果。而除掉色素和脂類物質的提取液抑菌效果較好，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現出高度敏感，鼠傷寒沙門氏菌表現出中度敏感。3種細菌對于同等質量濃度的青霉素均表現出高度敏感，在總體抑菌活性上：青霉素>提取液(除色素和脂類)>提取液(未經處理)>體積分數30%乙醇；柚樹葉黃酮提取液的最低抑菌質量濃度(MIC)為 0.074 mg/mL。

表3 柚樹葉黃酮類化合物的抑菌效果

3 結論

試驗表明，通過正交試驗優化的柚樹葉總黃酮最佳工藝條件為：乙醇體積分數80%，超聲時間50 min，料液比(m柚樹葉∶V乙醇)為1∶25(g/mL)，此條件下總黃酮提取量為11.746 mg/g。柚樹葉總黃酮提取液的質量濃度越大，其總還原力越強，經除去色素、脂類的柚樹葉總黃酮提取液的總還原力高于未經處理的提取液和抗壞血酸，是抗壞血酸的1.25倍?？傸S酮提取液的抑菌效果與其質量濃度呈正相關，其對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌具有不同程度的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌質量濃度為0.074 mg/mL。綜上，柚樹葉總黃酮具有良好的抗氧化和抑菌能力，后續將對其他方面的性質進行進一步研究。