利用二茂鐵檢測植物油過氧化值方法的建立

姚云平 于淼航 陳麗媛 劉 丹 李昌模，2

(1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.桂發祥十八街麻花食品〔天津〕有限公司，天津 300221)

油脂在工業生產以及人們日常生活中應用廣泛，油脂的質量與人們的健康息息相關。但是在生產加工以及使用過程中油脂會發生氧化，產生各種氧化產物，這些物質會對油脂的品質以及人們的健康產生不良影響[1]。

過氧化值(POV)是反映油脂新鮮程度和質量的重要指標[2]。碘量滴定法是目前檢測油脂過氧化值最常用的方法[3]。但是，碘化鉀對氧非常敏感，環境中的氧會影響其檢測結果[4]。有試驗[5]發現，油脂中的不飽和脂肪酸對碘有吸收作用，會導致檢測結果偏低。此外，碘量滴定法還存在操作繁瑣，取樣量大，試劑使用量大，反應終點不易判斷，檢測結果容易受到操作者主觀影響等問題[6-7]，這些因素都會影響檢測結果的準確性。

目前也有一些其他方法用于檢測油脂的過氧化值。如：化學發光(CL)法，該方法雖然可以檢測到較低濃度的脂質氫過氧化物，但是化學發光的強度卻容易受油脂的種類和濃度的影響[8-10]；傅里葉紅外光譜法，利用三苯基磷與氫過氧化物的反應可以定量檢測各種食用油的過氧化值，但是反應產物與三苯基膦的光譜存在交叉干擾的潛在風險[11-14]；2-硫代巴比妥酸(TBA)法，因其簡單和可重復性高且成本低而被廣泛應用于油脂、未加工的肉類和魚類產品等食品基質中[15]，但樣品需要經過高溫和酸處理，可能存在人為的過氧化反應，影響最終的檢測結果[16-17]；亞鐵離子氧化法[18-19]，具有簡單快速、試劑使用量小、特異性好等優點，但是其吸收系數會受到多種因素的影響，同時線性范圍窄，再現性低等問題也限制該方法的應用[20]。

二茂鐵是一種過渡金屬氧化物，由兩個環戊二烯和一個鐵原子組成[21-22]，具有可逆的氧化還原特性，常被用作還原劑或者催化劑。較其他檢測方法中使用的試劑，二茂鐵具有更好的熱穩定性和化學穩定性[23-24]。Chen等[25]報道了二茂鐵衍生聚合物探針在電化學生物傳感中的應用，該研究證明，基于二茂鐵聚合物的納米傳感器應檢測過氧化氫是可行的。Murgandani等[26]報告了一種靈敏、快速且具有選擇性的安培法測量亞油酸和亞麻酸及其氫過氧化物，該方法主要通過氫過氧化物氧化二茂鐵而形成陰極電流，通過對電流的測定評價樣品的氧化程度，且試驗結果不受還原劑和其他過氧化物的干擾。前人的研究證實了二茂鐵與氫過氧化物可發生計量反應的可行性。但是直接應用二茂鐵來檢測油脂的過氧化值還未見報道。

試驗擬以二茂鐵作為反應試劑，利用二茂鐵與油脂中的過氧化物發生的反應，采用化學計量學方法建立過氧化物與二茂鐵反應的線性關系，以期開發一種快速、準確、方便的油脂過氧化值的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生油：市售；

異丙醇、甲酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

過氧化氫異丙苯標準品(CHP)：純度80%，上海麥克林生化科技有限公司；

二茂鐵標準品：純度98%，上海麥克林生化科技有限公司；

紫外—可見光分光光度計：Evolution 300型，賽默飛世爾科技公司；

恒溫水浴鍋：HH-S型，江蘇國勝實驗儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準液及油樣制備

(1)二茂鐵標準溶液：準確稱取0.54 g二茂鐵標準品置于燒杯中，加入適量異丙醇溶解后倒入100 mL容量瓶中，用異丙醇定容，即得濃度為29 mmol/L的二茂鐵標準溶液，氮封后放置在4 ℃下備用。

(2)過氧化氫異丙苯溶液：準確稱取0.6 g過氧化氫異丙苯標準品(純度80%)置于10 mL棕色容量瓶中，異丙醇定容，配置成濃度為315.4 mmol/L的過氧化氫異丙苯母液，然后逐級稀釋為3.15～44.15 mmol/L的過氧化氫異丙苯溶液，氮封后放置在4 ℃下備用。

(3)油樣的制備：準確稱取0.4 g食用油置于10 mL容量瓶中，用異丙醇定容，氮封后放置在4 ℃下備用。

1.2.2 最佳吸收波長的確定 分別取15.77，7.89 mmol/L的過氧化氫異丙苯溶液各1 mL于2支干凈的試管中，各加入1 mL二茂鐵標準溶液和0.1 mL甲酸后用異丙醇定容至5 mL(相當于過氧化氫異丙苯的濃度為3.15，1.58 mmol/L)。在恒溫水浴鍋中60 ℃下反應40 min，反應結束后立即用流動的水冷卻至室溫，使用紫外分光光度計在200～600 nm范圍內進行全波長掃描，異丙醇作為空白校準基線，通過對比樣品吸光度之間的關系，按式(1)計算離散系數，確定最佳吸收波長。

(1)

式中：

Vs——離散系數；

σ——吸光度值的標準差；

μ——吸光度值的平均值。

1.2.3 反應摩爾比的確定 取0.1 mL二茂鐵標準溶液和1 mL不同濃度(3.15～44.15 mmol/L)的過氧化氫異丙苯溶液于不同的試管中，加入0.1 mL甲酸后用異丙醇定容至5 mL。在60 ℃的恒溫水浴條件下加熱40 min，結束后立即用流動水冷卻至室溫，使用異丙醇校準基線在310 nm處檢測吸光度值，通過二茂鐵與過氧化氫異丙苯在不同摩爾比時的吸光度確定二者反應的飽和摩爾比。

1.2.4 酸催化劑的選擇 試管中加入1 mL二茂鐵標準溶液后，加入1 mL 濃度為15.77 mmol/L的過氧化氫異丙苯溶液，然后分別加入0.1 mL有機酸(甲酸，乙酸)和無機酸(硫酸)，異丙醇定容至5 mL。60 ℃的恒溫水浴鍋中反應40 min，反應完成后在200～600 nm下進行全波長掃描。

1.2.5 溫度和時間的影響 選擇30，40，50，60，70 ℃ 5組不同的溫度。每個樣品中分別加入1 mL二茂鐵標準溶液和1 mL濃度為15.77 mmol/L的過氧化氫異丙苯溶液，加入0.1 mL甲酸后用異丙醇定容至5 mL，在不同的反應溫度下加熱40 min，反應后冷卻至室溫在310 nm處進行檢測。設置10，20，30，40，50 min反應時間，同樣的反應條件下在310 nm處檢測吸光度變化。

1.2.6 過氧化氫異丙苯標準曲線的繪制 取0.1，0.2，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1.0 mL濃度為15.77 mmol/L的過氧化氫異丙苯溶液于試管中，加入1 mL二茂鐵標準溶液和0.1 mL甲酸，異丙醇定容至5 mL，在最佳檢測條件下以過氧化氫異丙苯的濃度(x)為橫坐標，吸光度值(y)為縱坐標繪制標準曲線。按式(2)計算油脂過氧化值。

(2)

式中：

PV——過氧化值，mmol/kg；

Y——樣品的吸光度；

B——空白的吸光度；

A——標準曲線的系數；

M——取樣量，g；

V——定容體積，mL。

1.2.7 檢出限和定量限 參照文獻[27]的方法確定二茂鐵法的檢出限。在玻璃管中分別加入0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL的1.58 mmol/L的過氧化氫異丙苯溶液，再加入1 mL二茂鐵標準溶液和0.1 mL 的甲酸，用異丙醇定容至5 mL(相當于樣品中過氧化氫異丙苯濃度為0.00，0.03，0.06，0.10，0.13，0.16，0.19，0.22，0.25，0.28，0.32 mmol/L)。在恒溫水浴鍋中60 ℃加熱40 min，加熱結束后立即用流動水冷卻至室溫，在310 nm處檢測其吸光度。得到檢出限的估計值后按照加標濃度為估計檢出限的1～5倍范圍確定過氧化氫異丙苯添加量，在干凈的試管中加入合適的過氧化氫異丙苯溶液(15.77 mmol/L)，再加入1 mL二茂鐵標準溶液和0.1 mL 的甲酸，用異丙醇定容至5 mL，在60 ℃下加熱40 min，加熱結束后立即用流動水冷卻至室溫，在310 nm處檢測吸光度值，共檢測7組平行。根據式(3)求得方法檢出限，以方法檢出限的3.3倍為定量限。

LD=st(n-1,1-α)，

(3)

式中：

LD——方法檢出限，mmol/L；

s——加標樣品測試結果的標準偏差；

t——自由度為n-1時的Student's值，可查值表得到，當n=7時，在99%置信區間(α=0.01)下，t=3.14；

n——加標樣品數量，一般取7。

1.2.8 回收率 在試管中分別加入1 mL空白油樣、低加標油樣(3.15 mmol/L過氧化氫異丙苯)、中加標油樣(7.89 mmol/L 過氧化氫異丙苯)、高加標油樣(12.62 mmol/L過氧化氫異丙苯)，再加入1 mL二茂鐵標準溶液和0.1 mL的甲酸，用異丙醇定容至5 mL，在60 ℃條件下加熱40 min，然后在310 nm下檢測樣品的吸光度值。

1.2.9 滴定法測定過氧化值 按GB 5009.227—2016執行。

2 結果與分析

2.1 最佳吸收波長的確定

為了選擇最佳檢測波長，考察過氧化氫異丙苯濃度為1.58，3.15 mmol/L時與二茂鐵反應的全波長(200～600 nm)掃描圖，結果如圖1所示。

由圖1可知，在300～400 nm的范圍內隨著過氧化氫異丙苯濃度的增加樣品吸光度值變大，雖然最大吸收波長在318 nm處，但是通過對比吸光度值離散系數(表1)可知，在310 nm處吸光度值的離散系數最大，即在310 nm處的空白樣品的吸光度與標準樣品吸光度的差值最大，檢測最為靈敏。所以選擇310 nm為最佳檢測波長。

圖1 最佳檢測波長的優化

表1 不同波長下吸光度值離散系數

2.2 反應摩爾比的確定

由圖2可知，二茂鐵與過氧化氫異丙苯反應的飽和摩爾比(n二茂鐵∶n過氧化氫異丙苯)為1∶4，說明二茂鐵結構中2個環戊二烯可以與4個過氧化物結合或者每個環戊二烯與一個過氧化物結合，其余兩個過氧化物與鐵形成絡合物。為了保證在標準曲線范圍內二茂鐵過量且吸光度值處于檢測器的最佳檢測范圍，選擇二茂鐵標準溶液的濃度為29 mmol/L，過氧化氫異丙苯標準溶液的濃度為15.77 mmol/L。

圖2 過氧化氫異丙苯與二茂鐵反應摩爾比

2.3 酸性催化劑的優化

二茂鐵在酸性條件下與氫過氧化物反應，選擇硫酸、甲酸、乙酸，分別加入二茂鐵溶液以及二茂鐵與過氧化氫異丙苯的混合溶液中，并進行全波長掃描。結果發現由甲酸提供的氫離子濃度可使催化反應進行的同時，保證二茂鐵不分解，硫酸(強酸)使二茂鐵分解而乙酸存在下沒有顯示反應性，故選擇甲酸作為催化劑。

如圖3所示，隨著甲酸體積分數的增大，二茂鐵與過氧化氫異丙苯反應產物在310 nm范圍內的吸光度值不斷升高，表明酸性催化劑體積分數的升高有助于反應的進行。但是，過低的酸性條件可能會破壞二茂鐵與過氧化氫異丙苯反應產物的結構[28]。因此，最終選擇體積分數為2%的甲酸，驗證實驗也表明在該酸性催化劑條件下，過氧化氫異丙苯不會發生分解。

圖3 甲酸濃度對吸光度的影響

2.4 溫度對反應的影響

由圖4可知，二茂鐵與過氧化氫異丙苯的反應隨溫度的提高形成反應產物的含量不斷增加，當60 ℃后反應基本達到了平衡，溫度再升高其生成物含量變化微弱。考慮到氫過氧化物容易受到高溫的影響而發生變化，所以選擇60 ℃作為最佳反應溫度。

圖4 反應溫度對樣品吸光度的影響

2.5 反應時間的影響

由圖5可知，隨著加熱時間的延長反應產物含量增加，當在60 ℃加熱40 min時，二茂鐵與過氧化氫異丙苯的反應達到平衡狀態，即使增加反應時間反應產物含量恒定。故選擇40 min作為最佳反應時間。通過滴定驗證過氧化氫異丙苯濃度的方法檢驗過氧化氫異丙苯在60 ℃ 加熱40 min后的穩定性，結果表明在該條件下過氧化氫異丙苯不會發生變化。

圖5 反應時間對樣品吸光度的影響

2.6 標準曲線的制定

在310 nm處，過氧化氫異丙苯濃度和吸光度值之間的線性回歸方程為y=0.175 2x+0.220 2，R2=0.999 6。標準曲線線性方程呈現了良好的線性關系，可以作為過氧化物的定量方法用于檢測。濃度為0.00，0.03，0.06，0.10，0.13，0.16，0.19，0.22，0.25，0.28，0.32 mmol/L的過氧化氫異丙苯溶液與二茂鐵反應后在310 nm處的吸光度曲線結果如圖6所示。曲線在0.126 mmol/L處出現明顯拐點，在0.126～0.630 mmol/L的范圍內選擇空白樣品加標濃度為0.473 mmol/L，平行檢測7個樣品。7個平行樣品吸光度值的檢測結果為0.376±0.003，根據式(3)得到二茂鐵法的檢出限為0.08 mmol/L，定量限為0.26 mmol/L。

圖6 過氧化氫異丙苯在低濃度處的折點

2.7 添加回收率

稱取0.20 g花生油，添加0.1 mL濃度為3.15，7.89，12.62 mmol/L的過氧化氫異丙苯溶液配置成低、中、高加標油樣，轉換成過氧化物值分別為15.44，39.74，63.10 mmol/kg，稱取油樣時，每次稱取都有些差異導致過氧化物含量發生波動，計算結果如表2所示。

表2 二茂鐵法的添加回收率

計算結果表明，二茂鐵方法的加標回收率在98.16%～100.03%，二茂鐵檢測方法與過氧化物含量檢測結果具有很好的對應性，完全符合作為檢測方法對過氧化物的檢測，說明該方法能有效檢測油脂中的氫過氧化物含量。

2.8 兩種方法對實際樣品的檢測比較

取4組新鮮的花生油置于燒杯中，分別在120 ℃下加熱0，1，3，5 h，加熱后的樣品分別使用二茂鐵法和滴定法進行檢測。

以二茂鐵法測得過氧化值(mmol/kg)為橫坐標(x)，以滴定法測得過氧化值(mmol/kg)為縱坐標(y)，建立線性回歸方程。兩者的線性回歸方程為y=0.883 4x-3.590 3，R2=0.996 7，說明兩種方法對實際油樣的檢測結果具有良好的線性關系，但是也觀察到其斜率不為1，由于油脂體系較為復雜，二茂鐵可能會與油脂中的其他成分發生反應(含氧自由基、過氧自由基等)，導致檢測結果增大，這一現象需要通過進一步的試驗去解釋，同時也觀察到回歸方程與y軸不交于零點處，這可能是由于二茂鐵法中油脂完全處于有機試劑中，其氧化產物更容易被完全反應，所以其過氧化值較大。

圖7 植物油樣品兩種方法檢測結果的比較

3 結論

通過試驗，發現油脂中的過氧化物與二茂鐵進行反應具有對應關系；將二茂鐵方法與國標滴定法進行比較，發現兩種方法具有良好的線性關系，且二茂鐵法具有試劑性質穩定不受空氣和光照影響，取樣量少，試劑使用量少，操作過程簡單的特點。