冷鏈米飯多尺度結構的變化及慢消化淀粉形成機制

王麗麗 趙思明 林親錄 程云輝 周夢舟 張賓佳

(1.華中農業大學，湖北 武漢 430070；2.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004；3.長沙理工大學，湖南 長沙 410114；4.湖北工業大學，湖北 武漢 430068)

隨著冷鏈物流行業的迅速發展，冷鏈食品已占據中國食品市場的25%以上[1]。作為簡便經濟、即開即食、食用人群廣泛的冷鏈產品，冷鏈米飯是將蒸煮后米飯的中心溫度迅速降低至10 ℃以下，并在后續的各個流通環節中使米飯中心溫度保持在10 ℃以下的方便主食。感官品質及營養品質優良的冷鏈米飯具有十分廣泛的市場需求，但冷鏈米飯中的淀粉往往呈現較高的消化速率及快消化組分含量，致使餐后血糖水平高，易于加劇肥胖、糖尿病等代謝性疾病的風險[2-3]。因而，適宜降低淀粉的消化速率對生產低血糖指數的高品質冷鏈米飯具有重要意義。

米飯主要是由淀粉、蛋白質等營養組分構成的凝膠體系，組分分子在不同尺度組裝形成短程有序結構、結晶結構、納米結構和凝膠網絡，決定著米飯中淀粉的消化特性。前期研究顯示，米飯中淀粉長鏈比例的增加，有利于降低淀粉的消化速率[4]，而且其有序晶體含量越多、非周期性結構越致密，慢消化淀粉的含量越高[5-6]。實際上，冷鏈米飯在流通與消費過程中往往歷經3 d以內的低溫貯藏；且已有研究[7-8]表明貯藏過程可誘導蒸煮后的凝膠態淀粉鏈段組裝形成螺旋、結晶等結構，從而改變淀粉的消化速率、慢消化組分含量等特征。據此分析，控制冷鏈米飯的貯藏時間等條件因素可修飾米飯的多尺度結構，進而調控冷鏈米飯中淀粉的消化特性。然而，目前關于冷鏈米飯的研究多集中于加工及配送過程中的產品品質的變化[9-13]，仍未系統揭示冷藏過程如何影響米飯的多尺度結構及淀粉消化特性。

試驗擬以冷鏈秈米飯為研究對象，利用體外消化方法考察冷藏時間對米飯的淀粉消化速率和慢/抗消化淀粉含量的影響，綜合運用掃描電鏡、小角X射線散射、X射線衍射、紅外光譜等技術，研究冷鏈貯藏過程中米飯的微觀質地、納米結構、結晶結構、短程有序結構等不同尺度結構的變化。在此基礎上，從米飯多尺度結構水平探討短期貯藏(時間為1 d)如何強化米飯中慢消化淀粉組分的形成，為冷鏈米飯的淀粉消化特性調控及營養品質提升建立了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大米：桃花香米，淀粉含量為83.98%(干基)，襄陽賽亞米業有限公司；

消化酶：A3176型α-淀粉酶(活性25 U/mg)和10115型葡萄糖苷酶(活性64 U/mg)，美國Sigma-Aldrich公司；

F006-1-1型葡萄糖試劑盒：南京建成生物有限公司；

其余化學試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

電飯煲：CFXB50FC5-85型，浙江蘇泊爾股份有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，武漢科爾儀器設備有限公司；

真空冷凍干燥機：FD-1A-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司；

生物掃描電鏡：JSM-6390型，日本NTC公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：IS50型，美國Thermo Scientific公司；

X射線衍射儀：D8 ADVNCE型，德國布魯克AXS有限公司；

小角X射線散射儀：NanoSTAR型，德國Bruker-AXS公司。

1.2 方法

1.2.1 冷鏈米飯的制備 稱取300 g大米于電飯煲的內鍋中，用蒸餾水淘洗一遍，按照m米∶V水=1.0∶1.3(g/mL)加入去離子水，利用“精煮模式”進行蒸煮，經蒸煮后米飯的水分質量分數為55.04%。將米飯冷卻至37 ℃，稱取30 g新鮮米飯置于液氮中冷凍并進行冷凍干燥，將其余米飯按照30 g/份的量分別置于4 ℃ 的冷鏈環境中貯藏1～3 d，利用液氮冷凍后進行冷凍干燥。凍干后的米飯保留部分完整的米飯粒，其余樣品粉碎并過40目篩，置于干燥器中備用。

1.2.2 掃描電子顯微鏡(SEM) 利用鑷子將待測的凍干米飯粒掰開，橫斷面向上置于粘貼有雙面導電膠的樣品臺上，并將樣品臺置于離子濺射鍍膜儀中鍍金，取出樣品臺并置于樣品室中進行觀察和拍照，儀器工作電壓為15 kV，樣品的放大倍數為2 000倍和5 000倍。

1.2.3 小角X射線散射(SAXS) 參照文獻[14]并適當改動，以含水量80%的粉碎米漿為測試樣品，測試前將樣品在26 ℃平衡2 h，然后將樣品置于樣品臺上，采用Pilatus 1M檢測器采集樣品的散射數據，檢測時間為10 s。以水作為背景，對獲得的數據進行背景扣除和歸一化處理。樣品數據散射角度q的范圍為0.1～5.0 nm-1。

1.2.4 X射線衍射(XRD) 參照文獻[15]，將預先平衡好水分的米飯粉末置于樣品池中，利用X射線衍射儀檢測樣品的衍射數據，掃描區域為5°～35°、步長0.02°、步速1 s，光源為0.154 2 nm波長的單色Cu-Kα X射線，測試管壓30 mV、管流20 mA。

1.2.5 傅里葉變換紅外光譜(FTIR) 將樣品置于傅里葉紅外光譜儀的衰減全反射附件上，在4 cm-1的分辯率下采集樣品在400～4 000 cm-1波數范圍的譜圖，掃描次數為32次。以空氣作為背景，使用OMNIC軟件對所獲得的紅外光譜圖進行基線校正、歸一化處理以及去卷積處理(增強因子為1.9、半峰寬為19 cm-1)，然后計算995 cm-1和1 022 cm-1處峰強度的比值。

1.2.6 體外消化特性 參照文獻[7]，稱取含有90 mg淀粉的米飯粉末并置于含有6 mL醋酸鈉緩沖溶液(pH 6)和6 mL蒸餾水的離心管中。在37 ℃的條件下，添加5 mL 的混合酶溶液(42 U/mL的α-淀粉酶和42 U/mL葡萄糖苷酶)，開始消化。分別在0，5，10，15，30，45，60，90，120 min等時間節點，取0.1 mL消化溶液并加入至0.9 mL 無水乙醇中以終止反應。將混合溶液在4 000 r/min 下離心10 min。以1.0 mg/mL的葡萄糖溶液作為標準溶液，用葡萄糖試劑盒(GOPOD試劑)測定消化液的吸光值，根據式(1)計算淀粉消化量隨時間的變化。

(1)

式中：

SD——淀粉消化率，%；

Asample——樣品吸光值；

Aglucose——葡萄糖標準品的吸光值；

10×210——21 mL的消化液中取0.1 mL并與0.9 mL 無水乙醇混合所涉及的換算系數；

162/180——淀粉葡萄糖單元與游離葡萄糖的質量比。

通過一階動力學方程[式(2)]和LOS方法[the logarithm of the slop；式(3)]進一步轉換分析米飯淀粉的消化特性。

Ct=C∞(1-e-k×t)，

(2)

(3)

式中：

Ct——t時刻米飯淀粉的水解量，%；

C∞——消化結束時淀粉消化量的估算值，%；

k——消化速率常數，min-1。

根據計算出的消化數據(ln[(Ci+2-Ci)/(ti+2-ti)])和除最后兩點外的時間點[(ti+2+ti)/2]獲得LOS圖。根據ln(dCt/dt)與時間t數據的斜率變化反映消化速率不同的階段，并根據一階動力學方程的非線性曲線的擬合得到相應階段的淀粉消化速率k。同時，按照Englyst方法[16]，計算快消化淀粉(rapidly digestible starch，RDS)、慢消化淀粉(slowly digestible starch，SDS)以及抗消化淀粉(resistant starch，RS)的含量。

1.3 數據分析處理

采用Excel 2010和SAS 9.2 進行數據統計分析，顯著性分析水平為P<0.05，樣品數據均表述為均值±標準偏差的形式。

2 結果與分析

2.1 微觀形貌

圖1為冷藏前后米飯斷面形貌的SEM圖片。由圖1可知，新鮮米飯(0 d)中不存在大米原料的淀粉顆粒，在丁毅等[17]的研究中也有類似現象。樣品呈三維多孔樣的疏松質地，表明蒸煮過程中的水熱效應充分破壞了淀粉及蛋白質自身的有序結構，促使淀粉糊化和蛋白質變性從而成三維凝膠網絡狀質地。在冷藏環境中存放1 d能夠降低米飯質地中孔洞的尺寸，這是由于貯藏過程中米飯的淀粉與蛋白質分子逐漸從凝膠網絡壁中溶出，致使凝膠網絡結構部分塌陷，從而形成更為均一的微觀質地。延長貯藏時間進一步弱化了米飯的多孔樣質地，但程度相對較小。

圖1 不同冷藏時間米飯的掃描電子顯微鏡圖片

2.2 納米結構

圖2為不同冷藏時間米飯的小角X射線散射圖譜。由圖2(a)可知，蒸煮后的新鮮米飯未呈現天然淀粉層狀結構的散射峰[18-19]，但在0.5 nm-1附近出現了強度較低的寬散射峰，這是由于蒸煮過程中的水熱效應完全破壞了大米原料中的天然淀粉層狀結構[20]，但新鮮米飯中仍存在少量由淀粉及蛋白質分子組裝形成的有序結構，此類有序結構在納米尺度上與無定型區域組裝構成了非周期性的納米結構[6]。

由圖2(b)可知，冷藏1 d后米飯散射峰的位置向小角度偏移至0.3 nm-1處，且其強度明顯增加，表明淀粉及蛋白質分子在貯藏過程中形成了更多的有序結構，這些結構結合無定型區域形成了尺寸更大且更為規整的非周期性結構[21]。同時，與新鮮米飯不同，冷藏后的米飯在3.9 nm-1也出現了明顯的散射峰，這是由于淀粉的短程有序結構(雙螺旋)與36個水分子借助氫鍵組裝形成了B型淀粉晶體的六方晶胞[7]。延長冷藏時間適度增加了兩個散射峰的強度，但并未明顯改變散射峰的位置。由此可知，增加冷藏時間促使米飯形成了更為規整的結晶結構及非周期性結構，但變化程度較低且非周期性結構的尺寸未能進一步增加。

圖2 不同冷藏時間米飯的小角X射線散射圖譜及洛倫茲校正后的圖譜

2.3 結晶結構

圖3為不同冷藏時間米飯的X射線衍射圖譜。新鮮米飯(0 d)未呈現大米原料的A型淀粉結晶結構衍射峰[22-23]，主要以非晶態的形式存在，僅在2θ衍射角度20°附近呈現十分微弱的衍射峰。因此，蒸煮過程中的水熱效應大幅破壞了大米結構中的分子水平氫鍵網絡，致使大米中原有的A型淀粉晶體消失，僅存在少量的熱穩定性較高的V型淀粉晶體[8]。

圖3 不同冷藏時間米飯的X射線衍射圖譜

與新鮮米飯相比，冷藏1 d后米飯的V型結晶峰適度增強，并在衍射角度17°附近呈現微弱的衍射峰；由此可知，米飯中的淀粉鏈段在冷藏過程中重組裝形成了B型淀粉晶體及V型淀粉晶體，這與前期研究中貯藏前后熱加工淀粉結晶結構的變化規律相近[21]。然而，冷藏前后衍射圖譜中B型晶體特征峰強度的變化幅度，明顯低于小角散射圖譜中B型晶體特征峰強度的變化。這與以下原因有關：同步輻射裝置的小角散射圖譜對結構的測試分辨率明顯優于實驗室裝置的衍射圖譜，而且淀粉分子具有十分典型的液晶特性[24]，其鏈段可在小角散射測試的水環境中轉化為近晶態，從而使冷藏過程中淀粉結晶結構的變化易于被觀測到。延長冷藏時間對米飯X射線衍射圖譜特征的影響較小，這與小角X射線散射結果的變化規律相似，即進一步增加冷藏時間并未大幅度強化米飯的結晶結構。

2.4 短程有序結構

圖4為冷藏不同時間米飯在800～1 200 cm-1范圍內的紅外光譜圖，此范圍的圖譜與C—O及C—C伸縮振動有關，可用于表征淀粉構象及其與水分子的相互作用[25]。研究證實，淀粉紅外譜圖中1 022 cm-1附近的吸收強度與無定型態淀粉的相對含量呈正相關，995 cm-1附近的吸收強度與淀粉螺旋等短程有序結構的含量具有正相關關系[26-27]，相應紅外吸收峰強度之比(R995 cm-1/1 022 cm-1)可用于表征淀粉類樣品中短程有序結構的相對含量[28-29]。

經蒸煮后米飯的R995 cm-1/1 022 cm-1明顯降低，即蒸煮過程的水熱效應亦明顯破壞了淀粉的螺旋內氫鍵作用，從而大幅減少米飯中淀粉短程有序結構的含量。課題組[6]近期研究也表明，蒸煮作用能夠明顯破壞糙米飯中淀粉的短程有序結構比例。較之新鮮米飯，貯藏1 d后米飯的R995 cm-1/1 022 cm-1明顯升高(見圖4)，即冷藏過程促進了淀粉分子重組裝及短程有序結構的形成。進一步延長冷藏時間未能明顯增加R995 cm-1/1 022 cm-1的數值，該結果與結晶結構及納米尺度結構的變化規律相近，即增加冷藏時間主要是提升短程有序結構的規整程度但對其相對含量的影響較小。

2.5 消化特性

冷藏前后米飯的淀粉消化數據及其擬合曲線與LOS數據見圖5，樣品的消化特征參數如表1所示。新鮮米飯呈現消化速率明顯不同的兩個階段(階段一的消化速率k1高于階段二的消化速率k2)。前期研究也證實提取后的淀粉在消化過程中也可能呈現單個階段、兩個階段或3個階段[30-33]。由表1可知，冷藏過程降低了米飯的消化速率k1，促使米飯中的部分快消化淀粉RDS轉化為慢消化淀粉SDS，但未明顯改變階段二的消化速率k2及抗消化淀粉RS含量。冷藏1 d后米飯的慢消化淀粉含量達到40%左右。隨著冷藏時間延長至2 d，米飯的消化速率k1與k2、快消化淀粉RDS含量等特征參數未發生明顯改變，但其部分慢消化淀粉SDS轉化為抗消化淀粉RS；進一步延長冷藏時間則未明顯改變米飯的消化特征參數。由此可見，改變冷鏈米飯的貯藏時間能夠調控冷鏈米飯的消化特性，1 d的短期冷藏能夠明顯降低米飯的消化速率k1，并顯著提升其慢消化淀粉SDS含量。該現象的形成機制可基于冷鏈米飯多尺度結構的變化規律以及淀粉消化的理論進行探討。

表1 不同冷藏時間米飯的消化特征參數?

圖5 不同冷藏時間米飯的淀粉消化曲線、LOS曲線和非線性擬合曲線

米飯中淀粉的消化由α-淀粉酶、葡萄糖轉苷酶等淀粉酶共同完成，酶分子在米飯結構中的遷移及酶—淀粉鏈段復合物的形成決定著淀粉的消化速率等特征[34-35]。上述結果顯示，蒸煮過程中的水熱效應明顯破壞了大米中的蛋白體和淀粉的顆粒結構、層狀結構、結晶結構和短程有序結構，淀粉及蛋白質分子從原有的多尺度結構中解組裝，并結合水分子形成了多孔狀的凝膠體系。與新鮮米飯相比，短期冷藏過程(1 d)能夠降低米飯質地中微孔的尺寸，誘導分子重組裝形成規整程度較低的短程有序結構、B+V型淀粉晶體及尺寸更大的非周期性納米結構，促使米飯中形成了更多的慢消化態的多尺度結構域，減緩了結構中酶分子的遷移及酶分子—淀粉鏈復合物的形成，由此降低米飯的淀粉消化速率并增加其慢消化淀粉含量，但未明顯促進抗消化淀粉的生成。然而，延長冷藏時間雖未顯著改變米飯的微觀形態和其他尺度結構的相對比例，但提升了米飯中非周期性納米結構、淀粉晶體、短程有序結構等的規整程度，促使部分慢消化態結構區域轉化為抗消化態結構域，抑制了消化酶分子活性位點對部分淀粉糖苷鏈段的吸附水解，導致慢消化淀粉含量降低和抗消化淀粉含量增加。

3 結論

試驗從多尺度結構變化的角度系統研究了貯藏過程中冷鏈米飯中慢消化淀粉組分形成的機制。結果顯示，時間為1 d的短期冷藏能夠明顯強化米飯中慢消化淀粉組分的形成。由結構分析數據可知，短期冷藏過程一方面促使米飯中的分子鏈段重組裝形成短程有序結構(淀粉螺旋等)、長程淀粉晶體以及尺寸更大的非周期性納米結構，另一方面降低了米飯中微米尺度上的孔隙尺寸，即微觀質地的均一性提升。此類結構變化強化了米飯中慢消化態結構域的形成，促使部分快消化淀粉轉化為慢消化淀粉并降低米飯中淀粉的消化速率，相應米飯的慢消化淀粉比例可達40%左右。與此不同，更長時間的冷藏過程則提升了米飯微觀質地的均一性和短程有序結構、淀粉晶體以及非周期性納米結構的規整程度，誘導部分慢消化態結構區域轉化為抗消化態結構域。