重組人干擾素α-2b溶液型鼻腔給藥制劑穩定性初探研究

胡樂非，董明明，林 霞

0 引言

干擾素 α-2b 屬于I型干擾素，臨床應用于抗病毒、抗腫瘤及治療急慢性病毒性肝炎，在新冠肺炎治療中得到了廣泛應用，它由165～166個氨基酸組成，其分子量約為19kD[1]。干擾素可與靶細胞表面受體相結合，刺激細胞內多種效應蛋白質分子合成，包括阻止細胞核糖體翻譯的病毒蛋白；弱化轉錄酶活性的蛋白，從而抑制mRNA的形成，同時還可以形成病毒核酸對應的核酸酶，從而降解病毒核酸[2-3]。

目前霧化吸入注射用干擾素 α-2b已被新冠肺炎診療方案推薦用于一般治療。但霧化吸入療法需要特殊裝置，不利于疾病的預防及早期治療。干擾素 α-2b鼻腔給藥制劑，經鼻黏膜給藥，可在局部直接發揮抗病毒作用。此外，鼻腔部位存在豐富的毛細血管和淋巴管，鼻腔上皮與血管壁緊密相連，上皮細胞間間隙較大，具有較高的滲透性，且鼻腔部位蛋白酶含量較低，也可吸收入血，通過其他途徑發揮抗病毒作用[4]。給藥無需醫院的霧化吸入給藥裝置，有效避免特殊時期交叉感染，患者順應性好。

由于干擾素α-2b為蛋白類藥物，其水溶液穩定性較差。因此，本文系統考察了緩沖體系pH、緩沖體系磷酸鹽的濃度、穩定劑的種類及濃度、組合穩定劑對干擾素α-2b穩定性的影響，旨在開發一種穩定的干擾素α-2b溶液型鼻腔給藥制劑。

1 儀器與試藥

重組人干擾素α-2b干擾素原液(上海華新生物高技術有限公司，批號：B202005025，純度99.9%，生物學活性2.1×108IU/ml，蛋白濃度1.1 mg/ml)；磷酸二氫鈉(二水)、無水磷酸氫二鈉、氯化鈉、賴氨酸、組氨酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；吐溫80(南京威爾有限公司)，娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，蒸餾水。

分析天平 BSA124S(賽多利斯科學儀器有限公司)；SHK-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州科泰實驗設備有限公司)；離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州科泰實驗設備有限公司)；pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；冰箱(青島海爾科技有限公司)；SHZ-B水浴恒溫振蕩器(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司)；移液器(大龍興創實驗儀器股份公司)。

2 方法與結果

2.1 體外分析方法

2.1.1 色譜條件 參照《中國藥典》2020版測定蛋白含量，色譜柱以適合分離分子質量為5～60 kD蛋白質的色譜用凝膠為填充劑。色譜柱：TSK gel G200SWXL(7.8 mm×30 cm，5 μm)；流動相為：0.1 mol/L磷酸鹽-0.1 mol/L氯化鈉緩沖液，pH 7.0；流速：1 ml/min；進樣體積：50 μl；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃。

2.1.2 線性關系考察 分別精密量取1 ml干擾素原液置于容量瓶中，流動相稀釋定容至 5、10、25、50、100 ml，分別得到蛋白濃度為220、110、44、22、11 μg/ml的干擾素標準溶液。離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，進樣，于“2.1.1”項下測定峰面積。濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，R2=0.999 5滿足測試要求。

2.1.3 精密度試驗 取 “2.1.2”項下濃度為11 μg/ml的干擾素標準溶液適量，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，取上清液，于“2.1.1”項下連續進樣6次，記錄峰面積，結果峰面積RSD=0.44%，小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性考察 取“2.1.2”項下濃度為44 μg/ml的干擾素標準溶液適量，室溫下放置，在 0、4、8、12、24 h，取樣離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，于“2.1.1”項下進樣，考察主峰面積的變化。結果顯示，室溫放置樣品的峰面積RSD值為 0.92%，小于2.0%，穩定性較好。

2.1.5 濾膜吸附性考察 取“2.1.2”項下濃度為44 μg/ml的干擾素標準溶液適量，用 0.22 μm聚醚砜微孔濾膜過濾，每次過濾1 ml，取濾液作為供試品，直至過濾樣品峰面積不再發生變化，同時以離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)的溶液作為對照，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，考察主峰峰面積的變化情況。結果顯示，分別過濾棄去1、2、3 ml初濾液后，峰面積并無明顯變化，RSD值為0.31%，說明濾膜對樣品溶液的吸附作用可忽略不計，無需棄去初濾液。

2.2 磷酸鹽緩沖體系pH的篩選 由于鼻腔給藥制劑pH過高或過低，可能引起鼻黏膜刺激，因此，需將干擾素α-2b溶液pH值調節至與生理環境接近的pH范圍。而pH值亦可顯著影響干擾素α-2b的穩定性。因此，本文考察了pH值5.0～7.5范圍內干擾素α-2b溶液的穩定性。

采用不同比例的磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉的溶液，配制pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5且濃度為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖體系。以干擾素α-2b蛋白總濃度的變化篩選磷酸鹽緩沖液的pH值。精密量取1 ml干擾素原液與9 ml不同pH值磷酸鹽緩沖液置于10 ml的EP管中，在37 ℃的水浴條件下考察穩定性，以0 h干擾素α-2b蛋白濃度作為對比，分別于0、2、4、6、8、12、24 h取樣，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)進樣分析，結果見圖1。

圖1 不同pH緩沖液下干擾素α-2b蛋白相對百分含量結果

圖1顯示，當pH值為5.5、7.0、7.5時，干擾素穩定性較高，24 h后干擾素α-2b的相對百分含量分別為0 h的87.1%、89.9%、92.1%。其中pH為7.0和7.5時優于pH 5.5。而當pH為5.0、6.0和6.5時，干擾素的穩定性較差。α-2b干擾素在近中性(pH 7.0)環境中穩定性較高，酸性和堿性條件活性易降低，此外，本研究顯示，與pH為5.0、6.0和6.5時相比，pH 5.5環境下，蛋白濃度下降較為緩慢?？赡苁怯捎诟蓴_素等電點為4.0～6.7，在此pH范圍內，干擾素凈電荷為0，易聚集沉淀，導致蛋白濃度下降。在此pH范圍內，由于離子環境微小差異，其聚集程度也有所區別。pH 5.5時，干擾素聚集速率略低于其他相近pH，從而導致蛋白濃度下降較為緩慢。

基于上述結果，當pH為7.0時為中性，對鼻腔的刺激性較弱，初步選擇pH為7.0的磷酸鹽緩沖液作為緩沖體系。

2.3 磷酸鹽緩沖液濃度的考察 分別配制濃度為5、10、20、50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，精密量取1 ml干擾素α-2b原液與9 ml不同濃度的磷酸鹽緩沖液于10 ml的EP管中，以0 h干擾素α-2b蛋白濃度作為對比，考察37 ℃的穩定性。分別于0、4、6、8、12、24、48、72、144 h取樣，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)進樣，HPLC分析，結果見圖2。

圖2 不同濃度磷酸鹽緩沖液中干擾素α-2b蛋白含量結果

圖2顯示，當磷酸鹽緩沖液的濃度為10 mmol/L時，24 h內穩定性較好，因此，確定磷酸鹽緩沖液的濃度為10 mmol/L。

2.4 不同穩定劑的考察 蛋白制劑中多含有一定濃度穩定劑，以提高穩定性[5-7]。氨基酸對蛋白質的空間結構有一定的支撐作用，同時氨基酸可以作為抗氧化增效劑，如：組氨酸、賴氨酸等均具有較強的抗氧化作用。EDTA二鈉是一種重要的螯合劑，可以螯合溶液中的金屬離子，防止金屬離子引起制劑變色、變質、變濁等氧化降解。聚山梨酯80為親水型非離子表面活性劑，常用做助溶劑、乳化劑和穩定劑，也具有一定的穩定作用。

本文分別考察濃度為1 mg/ml的聚山梨酯80、EDTA二鈉、賴氨酸、組氨酸，以及賴氨酸與EDTA二鈉的組合作為穩定劑，同時以不含穩定劑的磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)藥物溶液為對照(即空白組)，優化穩定劑種類。

精密量取1 ml干擾素原液與9 ml含有不同穩定劑的磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)于10 ml的EP管中，以0 h干擾素α-2b蛋白濃度為對比，考察不同溶液在37 ℃條件下的穩定性。分別于0、4、8、12、24、48、72、144 h取樣，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，HPLC分析，結果見圖3。

圖3 不同穩定劑溶液體系中干擾素α-2b蛋白含量結果

圖3顯示，與不含穩定劑的干擾素α-2b溶液相比，分別以1.0 mg/ml EDTA二鈉、賴氨酸和組氨酸為穩定劑時，干擾素α-2b溶液穩定性顯著提高。1.0 mg/ml EDTA二鈉穩定作用顯著優于其他穩定劑，37 ℃水浴孵育6 d時，干擾素α-2b蛋白相對百分含量仍高達89.6%。

進一步考察組合穩定劑對干擾素穩定性的影響，結果顯示，與單獨加入EDTA二鈉或賴氨酸相比，加入組合穩定劑(賴氨酸+EDTA二鈉)，干擾素α-2b穩定性降低，這可能是由于賴氨酸降低了EDTA二鈉的絡合作用。

基于上述研究結果，確定穩定劑為EDTA二鈉。

2.5 穩定劑濃度的考察 以EDTA二鈉為穩定劑，pH值為7.0的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液為溶劑，優化穩定劑濃度。分別考察濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml的EDTA二鈉對干擾素α-2b穩定性的影響。

精密量取1 ml干擾素原液與9 ml含有不同濃度EDTA二鈉的磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)于10 ml的EP管中，以0 h干擾素α-2b蛋白濃度為對比，考察不同溶液在37 ℃條件下的穩定性。分別于0、4、8、12、24、48、72、144 h取樣，離心(12 000 r/min，10 min，10 ℃)，HPLC分析，結果見圖4。

圖4 不同濃度EDTA二鈉溶液中干擾素α-2b蛋白含量結果

結果顯示，隨著EDTA二鈉濃度的降低，干擾素α-2b穩定性逐漸降低，EDTA二鈉濃度為1.0 mg/ml時，穩定性顯著優于其他濃度。因此，確定EDTA二鈉濃度為1 mg/ml。

基于上述研究結果，確定干擾素α-2b溶液的組成為：10%(w/w)干擾素原液，1 mg/ml EDTA二鈉、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)。溶液中干擾素α-2b蛋白濃度為0.11 mg/ml，生物學活性為2.1×107IU/ml。該溶液可在37 ℃穩定6 d。

3 討論

當前新冠肺炎疫情在全球范圍肆虐，干擾素α-2b不僅作為此次新冠病毒感染的治療方案推薦，也是作為兒童抗病毒治療推薦藥物。但是干擾素作為蛋白類藥物，其穩定性較差且貯存條件較為苛刻，在此背景下開發一種處方簡單、穩定性較好、使用方便、適用于新冠疫情期間普通人群和隔離人群的預防以及早期感染者治療的干擾素制劑十分必要。

本研究系統考察了磷酸鹽緩沖體系pH值、緩沖體系磷酸鹽的濃度、穩定劑種類、穩定劑濃度對干擾素α-2b蛋白穩定性的影響，對干擾素α-2b干擾素溶液型鼻用制劑的處方進行了初步探索，確定磷酸鹽緩沖體系的濃度為10 mmol/L，且pH為7.0；篩選了4種常用穩定劑，EDTA二鈉穩定作用明顯優于其他3種穩定劑；EDTA二鈉濃度為1 mg/ml。后續將繼續考察干擾素α-2b在該溶液體系中的長期穩定性，為α-2b干擾溶液型鼻用制劑的開發提供基礎。