基于GC-MS八角楓對大鼠的肝臟代謝組學研究

茅銀燕，江夏娟，仝淑花，林崇良*

0 引言

中藥材八角楓[Alangiumchinense(Lour.)Harmssubsp.Chinense]，來源于八角楓科(Alangiaceae)八角楓屬(Alangium)植物[1]，廣泛分布于中國南方地區。八角楓的根、根皮、葉、花、皮[2]等均可入藥，莖民間稱為白龍條，須根民間稱為白龍須，可用于治療風濕、跌打損傷、外傷等[3-5]，臨床使用中主要以須根為主。中成藥制劑主要有風濕定片、膠囊[6]等。八角楓是一種有毒的中藥材，毒藜堿是八角楓的主要毒性成分，其中毒機制[7-9]為肌肉松弛作用和呼吸肌麻痹。本文應用代謝組學方法，探究八角楓對肝臟代謝的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠，(200±20)g，32只大鼠均飼養于溫州醫科大學實驗動物研究中心。動物使用許可證號：WYDW2019-0983。

1.1.2 試劑與藥品 三甲基氯硅烷(TMCS)、N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)、甲基羥基胺鹽酸鹽和吡啶(純度>98%)購自美國Sigma公司。HPLC級乙腈和正庚烷購自美國Merck公司。八角楓采自浙江省永嘉縣，經溫州醫科大學附屬第一醫院林崇良副主任中藥師鑒定為八角楓。取其須根20 g，加水200 ml，常壓下100 ℃水煎煮30 min，過濾，制備成八角楓煎煮液備用，0.1 g/ml。八角楓煎煮液經處理后UPLC-MS/MS定量檢測，含有毒藜堿39.5 μg/ml和水楊苷12.5 μg/ml。

1.1.3 儀器 GC-MS氣相色譜-質譜儀型號為6890N-5975B(美國Agilent公司)。色譜柱為HP-5 MS(0.25 mm×30 m，0.25 μm)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗 八角楓藥材分須根(直徑1 mm)、粗根(支根或側根，直徑3～5 mm)，須根毒性強，粗根毒性稍弱，主要有效成分為毒藜堿和水楊苷，水煎服成人用量為0.3～3 g，按比例換算大鼠每日劑量。將大鼠分為4組，每組8只。對應劑量具體分為對照組和3個劑量組：八角楓低劑量組0.25 g/kg、中劑量組0.5 g/kg、高劑量組1.0 g/kg。對照組口服1 g/(kg·d)生理鹽水14 d；八角楓低劑量組0.25 g/(kg·d)，八角楓中劑量組0.5 g/(kg·d)，八角楓高劑量組1.0 g/(kg·d)，均口服給藥14 d。第15天上午8∶00收集四組大鼠肝樣本，儲存于-80 ℃直至測量。

1.2.2 樣品制備 將大鼠處死后收集肝組織研磨至勻漿。將400 μl乙腈加入到100 μl肝勻漿中，渦旋1 min，在4 ℃下以10 000 g持續離心10 min。取上清液300 μl轉移到離心管中，氮氣吹干。再加入甲基羥胺鹽酸鹽(15 mg/ml吡啶溶液)50 μl，70 ℃甲肟化24 h。加入MSTFA(含1%TMCS作為催化劑)50 μl保持70 ℃ 1 h，加入150 μl正庚烷，離心取100 μl上清液保存，待測。

1.2.3 儀器條件 采用EI模式，在電子能量為70 eV、m/z50～550，使用全掃描模式，進樣選擇不分流模式。柱溫箱的初始溫度設定在80 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min速度持續升溫至300 ℃，保持5 min。

1.3 數據分析 SIMCA-P 13.0軟件(Umetrics，Umea，瑞典)，通過主成分分析(PCA)和PLS-DA處理由GC-MS所檢測的數據。根據 SIMCA-P13.0軟件中正常組與模型組的變量權重(Variable importance in the projection，VIP)，篩選出 VIP>1的變量，進一步行非參數檢驗。應用SPSS 18.0軟件，用獨立樣本t檢驗檢測兩組間代謝物的差異，P<0.05為差異統計學意義。

1.4 代謝標志物尋找及代謝通路分析 NIST2008標準譜庫檢索，結合使用KEGG數據庫 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)確定相關代謝生物標志物，導入MetaboAnalyst進行代謝通路分析。

2 結果

相同保留時間下，對照組與劑量組豐度差異明顯，血漿代謝物特征峰的保留時間和離子豐度值穩定，這表明在數據采集過程中氣質儀運行穩定可靠。

2.1 PCA與PLS-DA分析結果 從八角楓組3個劑量組與對照組大鼠PCA的比較結果可見，分離效果不理想，各組間有明顯的重疊，表明可能各組的肝臟代謝物難以明顯區分，PCA-2D R2Y=0.175，PCA-3D R2X=0.302，R2Y=0.175，如圖1所示。進一步使用PLS-DA得分圖進行分析。PLS-3D評分圖顯示，八角楓的3個劑量組與對照組分別可以明顯區分，且PLS-3D結果優于PLS-DA，隨著劑量增加，在PLS-3D上位置也有不同程度偏移，PLS-2D R2Y=0.109，PLS-DA-3D R2X=0.235，R2Y=0.109，見圖2。

圖1 大鼠肝組織樣品的PCA評分結果

圖2 大鼠肝樣品的PLS-DA評分結果

2.2 代謝標志物及其相對變化 圖3為肝組織的典型GC-MS代謝譜。NIST 2005數據庫檢索組織中的內源性代謝物，共約90種小分子化合物，包括氨基酸類、有機酸類、脂肪酸類等，GC-MS方法學的重復性RSD小于15%[10]。

圖3 大鼠肝樣品的GC-MS圖

本研究使用PLS-DA模型中的變量重要性投影(VIP)參數和獨立樣本t檢驗來評價內源性代謝物相對峰面積在對照組和劑量組之間的差異。只有同時滿足VIP>1和P<0.05才被認為可能是潛在的生物標志物。按上述原則，共從八角楓對照組和3個不同劑量組的代謝產物的變化對照中，發現了12個內源性生物標志物，見表1。結果表明，八角楓組和對照組比較，N,N-二丁基乙酰胺(N,N-dibutyl-Acetamide)、甘油(Glycerol)、丙氨酸(Alanine)、木糖醇(Xylitol)、山梨醇(Glucitol)、9,12-十八碳二烯酸[(Z,Z)-9,12-Octadecadienoic acid]、4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)(4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid)、α-麥角甾烯醇(alpha.-Ergostenol)降低，絲氨酸(Serine)、磷酸(Phosphoric acid)、棕櫚酸(Hexadecanoic acid)、D-葡萄糖醛酸(D-Glucuronic acid)升高。

表1 大鼠給予八角楓后血漿中代謝物的相對水平

2.3 代謝通路圖的構建 將得到的生物標志物進行代謝通路分析，MetPA潛在目標代謝途徑分析(影響值≥0.10)顯示，八角楓影響肝代謝紊亂最密切的6條代謝途徑是亞油酸途徑(Linoleic acid metabolism)、抗壞血酸和醛酸代謝(Ascorbate and aldarate metabolism)、糖醛酸途徑(Pentose and glucuronate interconversions)、甘油脂代謝(Glycerolipid metabolism)、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝(Glycine,serine and threonine metabolism)以及氨酰-tRNA合成(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)，見表2。不飽和脂肪酸在體內參與一系列氧化反應，能量水平的變化直接影響正常的生理代謝，這也反映在了代謝途徑的變化中,表明八角楓可能導致機體糖脂代謝紊亂，主要是通過影響肝的脂質過氧化、氧化應激等途徑來參與肝代謝。

表2 代謝通路及影響值

3 討論

傳統觀念認為，中草藥是安全有效的天然藥物，不良反應比化學藥物小，但相比西藥，服用中草藥及相關制劑引起的藥物性肝損傷最為多發，而其中又以民間自用驗方、單方制劑引起的藥物性肝損傷比例最高[11-12]。中藥成分繁多，藥理活性復雜，劑型、劑量、配伍變化多變，這導致其不良反應難以預測且多發，也導致中藥臨床用藥安全越來越被廣泛關注。肝臟作為藥物代謝最重要的器官，同時也是毒性反應最主要的靶器官，關于中藥引起肝損傷的臨床報道屢見不鮮。目前，有報道，引起肝臟損害的常用單味中草藥約有50多種[13]，而民間用藥品種更多且難以統計，中草藥引起肝損傷的成分主要以生物堿類為主，引發的肝損傷發病數和社會危害程度已經成為不可忽視的問題[14]，這也嚴重限制了中醫藥的國際化發展。

張長銀等[8]通過觀察八角楓急性中毒小鼠，發現中毒小鼠的肝細胞水樣變性，病變部位以肝小葉為主，伴匯管區淤血和靜脈擴張，說明肝臟是八角楓毒性作用的主要靶器官之一。八角楓的根皮、須根中含有水楊苷類、生物堿等物質，須根含量較高，具備較好的抗炎止痛作用，具備一定的開發前景和應用價值，在疼痛類疾病(如風濕)的治療中顯效明顯，目前以民間自用較多。臨床上也曾用作肌松劑，但是由于八角楓的生物堿所含有的毒性，劑量不易控制，毒性較大，故逐漸被取代。臨床工作中偶可見到因自行服用八角楓后出現麻痹的患者，還有服用八角楓導致死亡的案例[15-16]，這些都極大地限制了八角楓的臨床應用。

代謝組學是一種新的技術方法[17-18]，旨在研究生物系統(組織、器官、細胞模型或整個有機體)全部代謝物組成的功能和代謝，通過觀察生物系統受干擾或者刺激后的小分子代謝產物的改變來預測生物體系代謝途徑的改變。代謝組學非常適合中醫藥多系統、多靶點特點的整體研究特點，通過借助現代化的科技和手段，動態化監測中草藥給藥后內源性代謝產物的變化，以快速評價中藥毒性并分析其作用機制，尋找中藥肝損傷的早期生物標志物、探討中藥的肝毒性機制。

質譜廣泛應用于代謝組學研究，最常用的是液相色譜-質譜法和氣相色譜-質譜法。氣相色譜-質譜(GC-MS)用于樣品制備技術成熟，通過評估保留時間/索引和電子碰撞質譜來識別代謝物能力強，這些優點使其廣泛適用于代謝組學研究[19-20]。我們使用GC-MS技術結合多變量統計學分析方法研究了八角楓誘導的小鼠的代謝輪廓，分離效果較為滿意。經八角楓誘導的大鼠與對照組比較，許多代謝物的血漿水平發生了明顯變化，共篩選出12個內源性生物標志物。研究結果提示，在大鼠體內已經發生了糖、脂肪和蛋白質的代謝異常。不飽和脂肪酸能夠起到抗脂質過氧化作用，減少脂質過氧化對細胞的損傷，保護肝細胞的正常工作，一系列不飽和脂肪酸含量下降表明肝臟對炎癥的應激反應受到較大影響。糖類物質作為最基本的供能物質，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化過程被干擾導致能量供應產生障礙。氨酰-tRNA途徑影響蛋白質的合成，從而影響肝臟組織的穩定分泌、酶合成、解毒等重要功能。這表明八角楓能夠在一定程度上誘導肝代謝紊亂，其機制可能是八角楓影響肝臟的脂質代謝、氧化應激、氨基酸代謝有關。本研究將基于GC-MS和多變量統計學技術的代謝組學方法成功應用于八角楓對大鼠肝代謝的研究。