糖尿病視網膜病變患者PERK、CHOP和IRE表達水平變化意義分析

馮應華

許昌市第五人民醫院，河南 許昌 461100

糖尿病與心腦血管疾病、惡性腫瘤已成為威脅人類生命健康的主要影響疾病并具有顯著的老年化趨勢，發病率和死亡率逐年升高［1］。糖尿病多見微血管并發病變，以糖尿病視網膜病變（DR）發生率最高，嚴重降低了患者正常視力，亦是臨床致盲的重要原因［2］。對于糖尿病視網膜病變具體發生、發展機制尚不明晰，多認為是視網膜微血管病變損傷誘發。

內質網是細胞蛋白質合成及加工主要場所之一，細胞受到外部刺激后由于內部的內質網應激過程，可誘發一系列病理生理過程并有研究［3］提示糖尿病視網膜病變可能與內質網的應激反應及相關蛋白的異常凋亡存在關系。因此，本研究以內皮細胞內質網應激蛋白PERK、IRE及凋亡蛋白CHOP為研究重點，對糖尿病視網膜病變患者血清PERK、CHOP和IRE水平及意義進行了深入探討，現匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年8月在許昌市第五人民醫院治療的糖尿病患者210例，其中有糖尿病視網膜病變患者60例（DR組），其中非增殖期視網膜病變（NPDR）患者34例，增期期視網膜病變（PDR）患者26例，無視網膜病變患者150例（DM組），同時選取健康者100例作為對照組，DR組、DM組和對照組受試者性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。納入標準［4］：（1）糖尿病診斷符合1999年世界衛生組織制定的標準；（2）DR診斷符合2014年國際眼科理事會糖尿病眼部保健指南中的標準，視網膜病變經直接眼底鏡檢查或眼底熒光血管造影確診；（3）患者及家屬知情同意。排除標準：（1）合并有高血壓、惡性腫瘤、肝腎功能障礙、HIV感染等其他嚴重基礎性疾病；（2）有青光眼、白內障等眼部疾病；（3）1型糖尿病，見表1。

表1 DR組、DM組和對照組一般資料比較

1.2 實驗方法

采用Western blot檢測視網膜中PERK、CHOP和IRE表達。組織勻漿法提取視網膜組織總蛋白；取50 ug總蛋白SDS-PAGE裂解后轉膜，牛血清蛋白（30 g/L）2 h封閉、分別加入兔抗大鼠PERK、CHOP和IRE一抗，4℃孵育后加入辣根化得IgG二抗，暗室條件下曝光顯影［5］。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組組織PERK、CHOP和IRE表達水平

DR組組織PERK和IRE相對表達量明顯高于對照組和DM組（P＜0.05）；DR組組織CHOP相對表達量明顯高于對照組（P＜0.05），而與DM組比較無統計學意義（P＞0.05）；DM組組織PERK、CHOP和IRE相對表達量明顯高于對照組（P＜0.05），見表2、圖1。

表2 各組血清PERK、CHOP和IRE表達水平（±s)

注：a與對照組比較P＜0.05；b與DM組比較P＜0.05

組別對照組（n=100）DM組（n=150）DR組（n=60）FP PERK相對表達量0.412±0.098 1.022±0.103a 1.382±0.112ab 10.022＜0.050 CHOP相對表達量0.202±0.091 1.021±0.101a 1.011±0.110a 11.287＜0.050 IRE相對表達量0.312±0.110 0.570±0.102a 0.880±0.102ab 12.281＜0.050

2.2 DR組不同分型患者組織PERK、CHOP和IRE表達水平

DR組PDR患者組織PERK和IRE相對表達量明顯高于NPDR患者（P＜0.05）；DR組NPDR和PDR患者CHOP相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 DR組不同分型患者血清PERK、CHOP和IRE表達水平（±s)

分型NPDR（n=34)PDR（n=26)tP PERK相對表達量1.300±0.108 1.404±0.110-3.667＜0.050 CHOP相對表達量1.004±0.102 1.014±0.101-0.378＞0.050 IRE相對表達量0.821±0.103 0.922±0.104-3.748＜0.050

2.3 相關性分析

將DR患者組織PERK、CHOP和IRE表達進行相關分析，結果顯示：DR患者PERK和IRE呈正相關（r=0.402，P＜0.05）；CHOP與PERK、IRE無明顯相關性（P＞0.05）。

3 討論

糖尿病患者由于持續維持在高血糖及長期血糖不穩，誘發血小板凝集力升高，損傷微細血管，誘發微細血管局部膨大、水腫、滲漏、出血及阻塞等癥狀，而微細血管阻塞后由于視網膜缺氧致使視網膜血管大量增生并伴隨纖維增生，最終導致糖尿病視網膜病變［6-7］。研究［8］提示糖尿病視網膜病變的疾病進展后可造成黃斑部水腫而降低視力，玻璃體出血后還可造成突發性模糊，嚴重患者甚至出現視網膜剝離及新生血管性青光眼造成視力下降，但現階段的本病的具體機制尚不明晰。

內質網在保證內環境穩態的重要條件，但受到外界的強烈刺激后極易誘發內質網應激。內質網是蛋白質加工、合成及修飾出現異常的重要過程并被研究證實參與了糖尿病并發癥的發生、發展過程［9-10］。動物研究［11］提示糖尿病大鼠周圍神經內質網應激影響參與了大鼠周圍神經系統的異常過程并提出糖尿病視網膜病變中內質網應激發揮了重要作用。文獻［12］提示對于糖尿病視網膜病變的內質網應激導致的細胞凋亡參與了視網膜細胞損傷進程。本研究結果顯示DR組血清PERK和IRE相對表達量明顯高于對照組和DM組；DR組血清CHOP相對表達量明顯高于對照組，而與DM組比較無統計學意義；DM組血清PERK、CHOP和IRE相對表達量明顯高于對照組。該結果說明糖尿病視網膜病變患者PERK、CHOP和IRE表達明顯升高。PERK屬于elF2a上游激酶家族一種I型跨膜蛋白，在內質網膜上表達。內質網應激早期存在PERK信號通路的激活，該通路主要通過抑制蛋白質的合成對細胞起保護作用、促進細胞生存。研究［13］提示隨著內質網應激時間的延長及PERK特異性的磷酸酶去磷酸化抑制PERK，PERK通過誘導CHOP及IRE的表達而促進細胞凋亡，在調控的信號途徑在中樞神經系統及代謝異常等病理過程中發揮重要作用。研究［14］提示LPS誘導的細胞能夠抑制內質網鈣泵，誘發內質網應激反應，促進CHOP表達，這也與本研究結論一致。

進一步對DR組不同分型患者組織凋亡蛋白結果顯示DR組PDR患者組織PERK和IRE相對表達量明顯高于NPDR患者；DR組NPDR和PDR患者CHOP相對表達量比較差異無統計學意義。該結果說明增殖期視網膜病變PERK和IRE相對表達量明顯高于NPDR患者并存在較強的內質網應激反應。進一步將DR患者組織PERK、CHOP和IRE表達進行相關分析，結果顯示：DR患者PERK和IRE呈正相關；CHOP與PERK、IRE無明顯相關性。該結果說明糖尿病視網膜病變患者PERK、CHOP和IRE的異常表達可能與視網膜病變的發展具有密切關系，可能與內皮細胞內質網應激蛋白PERK、IRE及凋亡蛋白CHOP誘發的內質網應激反應關系密切。

PERK通路及CHOP通路均為內質網應激反應的兩條重要通路。PERK屬于蛋白激酶家族，內質網無應激時C端位于細胞質中，N端位于內質網腔，C端由蘇氨酸蛋白激酶活性，但缺乏核酸內切酶活性，而當內質網處于應激狀態時，PERK解離形成寡聚體并因自身磷酸化激活具有特異性的絲氨酸，降低蛋白翻譯水平，進而抑制胞內蛋白合成［15］。CHOP是內質網應激反應中的另一轉錄因子，正常條件下CHOP主要機體含量極低，但內質網應激狀態時CHOP表達量聚集于細胞核內，水平迅速升高進而加速細胞凋亡進程。此外，CHOP還具有調節Bcl-2基因等其他基因的轉錄，與cAMP反應元件結合蛋白形成二聚體促進線粒體對促凋亡因子的敏感性，抑制Bcl-2表達。

綜上所述，糖尿病視網膜病變患者PERK、CHOP和IRE表達明顯升高，可能在病變過程中有重要作用。