不同胃黏膜病變中livin、survivin、Pak-1和caspase-7的表達及其意義

姜姝羽 任麗梅 武金寶 婁佳欣 蘇琪皓 劉小芳

內蒙古科技大學包頭醫學院1(014040) 包頭醫學院第二附屬醫院消化內科2

胃癌是目前世界上常見的惡性腫瘤之一，其組織學演變遵循Correa級聯反應，即慢性非萎縮性胃炎(chronic non-atrophic gastritis, CNAG)-慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)-胃黏膜腸化生-異型增生-胃癌，其中腸化生是重要的癌前病變[1-2]。Livin和survivin均屬于凋亡抑制蛋白家族，是細胞凋亡中重要的調節因子，可抑制凋亡信號轉導過程中的caspase-3/7/9蛋白的活性[3]。p21蛋白活化激酶-1(p21 activated kinase-1, Pak-1)是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[4]。本研究通過采用免疫組化染色檢測胃癌及其癌旁、腸化生、CNAG組織中livin、survivin、Pak-1和caspase-7的表達，旨在探討三者在胃癌發生、發展過程中的作用，從而為胃癌的預防和診療提供理論基礎。

材料與方法

一、材料來源

選取2015年1月—2019年12月包頭醫學院第二附屬醫院病理科確診的45例原發性胃腺癌組織和相應癌旁組織(距腫瘤組織5 cm以上)，其中男25例，女20例；年齡45～80歲，平均62歲；低分化24例，中分化14例，高分化7例；腫瘤分期根據美國癌癥分期聯合委員會(AJCC)的第8版胃癌TNM分期，Ⅰ+Ⅱ期者16例，Ⅲ+Ⅳ期者29例。所有組織均在外科手術或內鏡黏膜下剝離術中獲取。另選取經病理檢查確診的CNAG組織45例、腸化生組織45例，均無其他惡性腫瘤史，術前未行任何抗癌治療。所有患者中男72例，女63例，年齡40～80歲，平均60歲。本研究方案已通過包頭醫學院第二附屬醫院醫學倫理委員會審批。

二、主要試劑

Livin、survivin、Pak-1和caspase-7兔抗人多克隆抗體(工作濃度均為1∶400)均購于美國Proteintech Group, Inc.，免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

三、免疫組化法

對組織切片先后進行免疫組化PV-9000二步法染色、DAB顯色、蘇木精復染、封片等，詳細步驟依照試劑盒說明書操作。以PBS液代替一抗作為空白對照，已知陽性組織切片作為陽性對照。

結果判斷：采用雙盲法，由2名經驗豐富的病理科醫師獨立觀察，若計數相差10%以上則重新計數。Livin、survivin主要表達于細胞質和(或)細胞核中，Pak-1主要表達于細胞質和(或)細胞膜中，caspase-7主要表達于細胞質中。高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野進行觀察，總染色評分為陽性細胞比例評分與染色強度評分之積，陽性細胞比例評分標準：<5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；75%，4分。染色強度評分標準：基本不著色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。總評分0～2分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

四、統計學分析

采用SPSS 25.0統計學軟件，率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達情況

在不同胃黏膜組織中，livin的陽性染色主要位于細胞質和(或)細胞核(圖1)，survivin的陽性染色主要位于細胞質和(或)細胞核(圖2)，Pak-1的陽性染色主要位于細胞質和(或)細胞膜(圖3)，caspase-7的陽性染色主要位于細胞質(圖4)。

A：胃癌；B：腸化生；C：CNAG；D：癌旁組織圖1 Livin在不同胃黏膜組織中的表達(免疫組化染色，×100)

A：胃癌；B：腸化生；C：CNAG；D：癌旁組織圖2 Survivin在不同胃黏膜組織中的表達(免疫組化染色，×100)

A：胃癌；B：腸化生；C：CNAG；D：癌旁組織圖3 Pak-1在不同胃黏膜組織中的表達(免疫組化染色，×100)

A：胃癌；B：腸化生；C：CNAG；D：癌旁組織圖4 Caspase-7在不同胃黏膜組織中的表達(免疫組化染色，×100)

胃癌組livin、survivin、Pak-1的陽性表達率明顯高于腸化生組、CNAG組和癌旁組(P<0.05)，腸化生組又明顯高于CNAG組和癌旁組(P<0.05)，而CNAG組與癌旁相比無明顯差異(P0.05)。胃癌組caspase-7的陽性表達率明顯低于腸化生組、CNAG組和癌旁組(P<0.05)，腸化生組又明顯低于CNAG組和癌旁組(P<0.05)，而CNAG組與癌旁組相比無明顯差異(P0.05；表1)。

表1 各組中livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達情況n(%)

二、Livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達與胃腺癌臨床病理特征的關系

Livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達與胃癌患者分化程度、TNM分期、浸潤深度和有無淋巴結轉移均密切相關(P<0.05)，而與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小無關(P0.05；表2)。

討 論

Livin通過拮抗caspase-3、caspase-7、caspase-9和第2個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑/低等電位點的凋亡抑制蛋白的直接結合蛋白的活性來抑制腫瘤細胞凋亡[5]。本實驗結果表明，livin的陽性表達率在胃癌組、腸化生組、CNAG組和癌旁組中呈下降趨勢，且胃癌組中陽性表達率明顯高于腸化生組、CNAG組和癌旁組，這與孟加榕等[6]的研究結果一致。同時，腸化生組livin陽性表達率又明顯高于CNAG組和癌旁組，而CNAG組與癌旁組無明顯差異。提示livin表達上調可能在胃黏膜由炎癥向腸化生以及惡性轉化中扮演重要角色，腸化生可能是胃黏膜由良性病理階段向胃癌階段發展的危險過渡階段，是進行干預的最佳節點。

Survivin通過抑制caspase-3和caspase-7的活性抑制細胞凋亡，還通過調節細胞周期對抗G2/M期凋亡的誘導，使細胞逃離凋亡檢查點。此外，survivin還與血管內皮生長因子共同調節腫瘤血管，促進腫瘤生成[7-8]。本實驗結果表明，survivin的陽性表達率在胃癌組、腸化生組、CNAG組和癌旁組中呈下降趨勢，且胃癌組中陽性表達率明顯高于腸化生組、CNAG組和癌旁組，這與董麗麗等[9]的研究結果一致。同時，腸化生組survivin陽性表達率又明顯高于CNAG組和癌旁組，而CNAG組與癌旁組無明顯差異。提示在慢性胃炎向胃癌演變的過程中，survivin蛋白的凋亡抑制作用逐步加強，部分異常細胞失去survivin介導的凋亡控制，導致細胞凋亡與增殖失衡，從而發生胃癌。

Pak-1由一個C末端激酶區和一個N末端調節區構成，其N末端調節區含有GTP酶結合區域，參與細胞表面和細胞內各種信號級聯過程，從而影響細胞周期、增殖與凋亡、炎癥發生、代謝等生理過程[10]。本實驗結果表明，Pak-1的陽性表達率在胃癌組、腸化生組、CNAG組、癌旁組中呈下降趨勢，且胃癌組中Pak-1的陽性表達率明顯高于癌旁組，這與李清[11]的研究結果一致。同時，腸化生組陽性表達率又明顯高于CNAG組和癌旁組，而CNAG組與癌旁組無明顯差異。提示Pak-1表達上調可能在胃黏膜炎癥向腸化生和惡性轉化中扮演重要角色，說明Pak-1蛋白表達是一個胃黏膜癌變的早期分子事件。

目前關于caspase-7在胃組織中的研究較少，其可能通過線粒體/細胞色素C通路、死亡受體通路和內質網通路這三種方式誘導細胞凋亡[12]。本實驗結果表明，caspase-7的陽性表達率在胃癌組、腸化生組、CNAG組和癌旁組中呈升高趨勢，且胃癌組中caspase-7陽性表達率明顯低于腸化生組、CNAG組和癌旁組，與楊彬等[13]的研究結果一致。同時，腸化生組陽性表達率又明顯低于CNAG組和癌旁組，而CANG組與癌旁組無明顯差異。提示caspase-7蛋白表達下調參與了胃癌的發生、發展過程。

本研究表明腸化生組livin、survivin、Pak-1的陽性表達率明顯高于CNAG組和癌旁組，胃癌組又高于腸化生組，說明livin、survivin、Pak-1異常表達發生于腸化生早期，阻斷其表達可能對胃癌的發生起有一定的抑制作用。后續實驗將對腸化生嚴重程度進行分級，同時增加異型增生組、低級別、高級別上皮內瘤變組，并檢測Ki-67進行進一步研究。本研究還發現livin、survivin、Pak-1、caspase-7蛋白表達與胃癌組織分化程度、腫瘤TNM分期、浸潤深度和淋巴結轉移相關(P<0.05)，提示上述蛋白表達強度可反映腫瘤的惡性程度與轉移程度，有可能成為評價胃癌發展和預后的參考指標之一，可能是有潛在價值的腫瘤標志物和腫瘤治療的新靶點。考慮2種及以上基因相互影響的具體作用機制尚不明確，為提供更多的參考依據以證明多基因之間存在協同作用，還需進一步在分子水平上進行研究。

綜上所述，livin、survivin、Pak-1和caspase-7可能成為胃腺癌臨床診斷、判斷療效和監測預后的指標之一。