炎癥性腸病患者腸黏膜FUT2、FUT3表達的臨床研究*

陳 鑫 李國熊 方家恒 孫倚天 董 賽 楊文君

杭州師范大學附屬醫院消化內科1(310015) 病理科2

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種在腸道菌群的參與下，由環境等因素作用于遺傳易感者引起的腸道黏膜異常免疫反應，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)。隨著發展中國家的工業化進程，其IBD發病率呈上升趨勢[1]。巖藻糖基轉移酶(fucosyltransferases, FUTs)可催化蛋白質完成巖藻糖基化，從而影響蛋白質的生物學功能，參與受體激活、信號轉導等多種重要的生命進程。其中，FUT2和FUT3可特異性催化人類組織血型抗原(histo-blood group antigens)形成，并與宿主與腸道微生物的相互作用以及IBD腸道黏膜炎癥之間存在密切聯系[2]。Coyne等[3]發現，擬桿菌可經由與宿主腸上皮細胞類似的途徑對其表面莢膜多糖和糖蛋白進行巖藻糖基化修飾，通過與宿主協調表達巖藻糖以保障自身定植；Goto等[4]發現由FUT2調控的腸上皮細胞巖藻糖基化對致病菌感染具有保護作用。然而，國內外相關研究多為動物實驗研究，關于IBD患者炎癥黏膜FUT2和FUT3表達的臨床研究鮮見報道。本研究收集IBD患者的臨床資料，結合結腸鏡活檢標本FUT2、FUT3表達檢測，旨在探討不同臨床特征IBD患者的FUT2、FUT3表達變化，以期有助于IBD的臨床診斷和療效評價。

對象與方法

一、研究對象

連續納入于2019年1月—2020年12月在杭州師范大學附屬醫院就診、初診為IBD活動期的漢族人群。IBD診斷符合2012年版我國IBD診治共識[5]。排除標準：①無法明確診斷；②其他腸道疾病，包括痢疾、腸結核、腸傷寒、耶爾森菌腸炎、彎曲桿菌結腸炎、嗜酸細胞性結腸炎、放射性腸炎、外傷、缺血性腸炎、結直腸黏膜脫垂綜合征、各種寄生蟲感染、阿米巴結腸炎、藥物性腸病、腸型白塞病、單純性潰瘍、淀粉樣變性等；③入組前2個月內使用抗菌藥物。結果共107例活動期IBD患者納入研究，同期行健康體檢、結腸鏡檢查無異常發現的66例漢族個體作為對照組。研究方案經醫院倫理委員會審核批準[2018(倫02)-KS-012]。

二、方法

1. 免疫組化染色檢測腸黏膜FUT2、FUT3表達：IBD組收集開始藥物治療前的結腸鏡活檢標本(取炎癥黏膜組織)，對照組收集正常結腸黏膜組織，4%甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋、連續切片，常規脫蠟，采用EnVision二步法行FUT2、FUT3免疫組化染色。兔FUT2、FUT3抗體為Biorbyt Ltd.產品，二步法免疫組化試劑盒(多聚HRP標記抗兔/鼠IgG，DAB顯色液)為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產品，按試劑盒說明書進行操作。光學顯微鏡下觀察到褐黃色陽性信號判定為相關抗原表達陽性，未觀察到褐黃色信號判定為表達陰性。由2名具有高級職稱的病理醫師讀片，協商得出結果。

使用用徠卡DMI4000B倒置顯微鏡對每張切片的FUT2、FUT3顯色結果進行觀察、定位。于高倍視野(×200)下隨機選取3個彼此不重疊的視野采集圖像，將同一張切片的3幅圖像輸入Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析，分別計算平均光密度(average optical density, AOD)，3幅圖像的AOD值均數作為該張切片的FUT2、FUT3相對表達量。

2. 臨床資料收集和疾病嚴重程度評估：采集入組IBD患者的人口統計學資料、生活習慣、臨床表現和實驗室檢查結果。實驗室指標主要包括C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)、糞便鈣衛蛋白(fecal calprotectin, FC)和血紅蛋白(hemoglobin, Hb)。炎癥指標結果異常判定標準：CRP10 mg/L；ESR26 mm/h；FC50 μg/g。

UC疾病嚴重程度的評估采用改良 Mayo評分，CD疾病嚴重程度的評估采用Best CD活動指數(CD activity indext, CDAI)。病變范圍/部位分型采用蒙特利爾分型[5]。

三、統計學分析

結 果

一、一般資料

107例IBD患者中，UC 70例，CD 37例。UC組男性48例，女性22例，年齡(49.6±15.6)歲(15～83歲)；CD組男性27例，女性10例，年齡(37.6±15.7)歲(15～72歲)。66例健康對照者中男性48例，女性18例，年齡(52.5±14.0)歲(18～87歲)。三組間性別構成和年齡差異均無統計學意義(P均0.05)。

二、腸黏膜FUT2、FUT3表達

IBD患者和健康對照者腸黏膜FUT2、FUT3顯色情況見圖1。CD組FUT2陽性率低于對照組，FUT3陽性率高于對照組，差異均有統計學意義(P均<0.05)；UC組與對照組間FUT2、FUT3陽性率無明顯差異(P均0.05；表1)。

A：非炎癥黏膜FUT2表達陽性；B：非炎癥黏膜FUT2表達陰性 ；C：非炎癥黏膜FUT3表達陽性；D：非炎癥黏膜FUT3表達陰性；E：IBD炎癥黏膜FUT2表達陽性；F：IBD炎癥黏膜FUT2表達陰性；G：IBD炎癥黏膜FUT3表達陽性；H：IBD炎癥黏膜FUT3表達陰性圖1 腸黏膜FUT2、FUT3顯色情況(免疫組化染色，×200)

表1 IBD組與對照組腸黏膜FUT2、FUT3表達陽性率比較

進一步根據AOD均值行半定量分析，UC組FUT2、FUT3相對表達量均高于對照組，CD組FUT2相對表達量低于對照組，FUT3相對表達量高于對照組，差異均有統計學意義(P均<0.05；表2)。

表2 IBD組與對照組腸黏膜FUT2、FUT3相對表達量比較

三、FUT2、FUT3表達與IBD患者臨床特征的關系

不同疾病嚴重程度、病變范圍/部位、臨床表現(腹痛、腹瀉、發熱、貧血)以及不同生活習慣(吸煙、飲酒)IBD患者的腸黏膜FUT2、FUT3表達差異均無統計學意義(P均0.05；表3、表4)。進一步行多元線性回歸分析，結果同樣表明FUT2、FUT3表達與IBD患者的臨床表現和生活習慣無明顯相關性(P均0.05；表5)。

表3 UC、CD組腸黏膜FUT2、FUT3表達與疾病嚴重程度和病變范圍/部位的關系

表4 UC、CD組腸黏膜FUT2、FUT3表達與臨床表現和生活習慣的關系

表5 腸黏膜FUT2、FUT3表達與IBD患者臨床表現和生活習慣的多因素分析(多元線性回歸分析)

四、FUT2、FUT3表達與炎癥指標的關系

CRP、ESR、FC水平升高與正常IBD患者的腸黏膜FUT2、FUT3表達分布見圖2。3項炎癥指標升高與正常組間FUT2表達差異均無統計學意義(P均0.05)；CRP、FC升高與正常組間FUT3表達差異顯著(P均<0.05；表6)。進一步行Pearson相關系數分析，結果同樣表明FUT2表達與各項炎癥指標之間無明顯相關性(P均0.05)，FUT3表達與CRP、FC水平之間存在一定的正相關性(r=0.259,P=0.007;r=0.388,P=0.001)。

圖2 CRP、ESR、FC水平升高與正常IBD組間FUT2、 FUT3 AOD分布比較

表6 IBD患者腸黏膜FUT2、FUT3表達與炎癥指標的關系

討 論

近20年來，中國IBD病例數呈增長迅速，流行病學調查顯示，南方城市IBD標化發病率為3.14/10萬，北方城市為1.77/10萬[6]。盡管臨床醫師對IBD的關注度已有明顯提升，但其精準診斷和治療仍面臨諸多挑戰。ABH抗原和Lewis抗原統稱人類組織血型抗原，其合成受FUT2、FUT3特異性調節(圖3)。FUT2、FUT3在胃腸道黏膜組織和分泌液中高表達，不僅可作為腸道菌群的碳源和結合位點，還可影響蛋白質的生物學功能，參與信號轉導、受體激活等諸多重要生命進程[2]。已有較多動物實驗研究證實FUT2、FUT3與IBD的發生、發展有關，但相關臨床研究鮮見報道。

圖3 人類組織血型抗原合成步驟

鑒于長期應用抗菌藥物會降低腸黏膜巖藻糖含量[7]，考慮到我國的抗菌藥物使用現狀，本研究設計時設定排除入組前2個月內使用抗菌藥物的患者。EnVison二步法免疫組化染色顯示，健康對照者腸黏膜FUT2、FUT3陽性率分別為78.8%、80.3%，UC和CD患者的相應數據分別為81.4%、84.3%和59.5%、94.6%，CD組與對照組間存在顯著差異。進一步行半定量AOD值分析，UC組FUT2、FUT3相對表達量顯著高于對照組，CD組FUT2相對表達量顯著低于對照組，FUT3相對表達量顯著高于對照組，表達變化趨勢與陽性率分析結果基本一致。單因素和多因素分析顯示，腸黏膜FUT2、FUT3表達與IBD患者的疾病嚴重程度(輕、中、重度)、病變范圍/部位(蒙特利爾分型)、臨床表現(腹痛、腹瀉、發熱、貧血)和煙酒嗜好均無明顯相關性；Pearson相關系數分析顯示，FUT3表達與臨床常用炎癥指標CRP和FC之間存在一定正相關性，CRP和FC升高者腸黏膜FUT3表達亦顯著升高；FUT2表達與CRP、ESR、FC之間均不存在相關性。

有研究顯示，20%的白種人因FUT2基因多態性而不表達ABO血型抗原[8]。關于FUT2基因多態性與IBD的關系，不同國家、不同種族人群的研究結果不完全一致。國內有學者分析了FUT2基因多態性對新疆地區漢族和維吾爾族人群UC易感性的影響，發現rs281377位點多態性與漢族人群的UC易感性相關，rs1047781位點多態性與維吾爾族人群的UC易感性相關，而rs601338位點多態性與兩組人群的UC易感性均相關[9]。另一項國內研究[10]則顯示FUT2基因多態性與東南地區人群的CD易感性相關，與UC易感性無關。其他國內學者的研究也證實了FUT2基因多態性與漢族人群CD易感性之間的相關性[11]。McGovern等[8]對白種人的全基因組關聯研究同樣表明FUT2基因多態性與CD易感性相關。韓國學者的研究[12]顯示，FUT2非分泌型等位基因與CD顯著相關，分泌型FUT2是亞洲人群罹患CD的保護因素。本組研究對象均為漢族，CD組FUT2陽性率僅為59.5%，遠低于對照組的78.8%，FUT2相對表達量亦顯著低于對照組，在蛋白水平證實了FUT2基因弱功能性或失功能性突變與CD易感性之間的聯系。此外，本研究還發現CD組FUT3陽性率和相對表達量顯著高于對照組。國內其他學者的研究表明FUT3基因rs28362459、rs3745635位點突變與特定病變部位的CD發病風險有關[11，13]。

盡管大量研究指出了FUT2、FUT3基因多態性與IBD易感性之間的聯系，但鮮有研究通過檢測兩者在腸黏膜中的表達變化分析其與IBD的關系。國內有學者采用免疫組化方法檢測了7例浙江籍漢族UC患者乙狀結腸黏膜中與FUT2、FUT3相關的Lewis a、b抗原表達，發現炎癥和非炎癥黏膜隱窩上皮的Lewis a抗原表達均顯著高于作為對照組的結腸息肉患者，其原因可能為FUT2基因突變使其編碼蛋白失去正常催化功能，血型前體物質不能被催化生成H抗原，而只能經由FUT3酶催化生成Lewis a抗原，導致Lewis a抗原過表達，通過影響腸道菌群結構，對UC發病起促進作用[14-15]。本組UC患者FUT2相對表達量顯著高于對照組，CD患者FUT2相對表達量顯著低于對照組，提示檢測腸黏膜FUT2表達或可為IBD的診斷以及UC與CD的鑒別提供幫助，但仍需增加樣本量進一步明確。

研究顯示炎癥反應可影響多種糖蛋白的糖基化水平。Delmotte等[16]發現促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可上調人支氣管黏膜中的FUT3基因表達及其酶活性，與嚴重肺部感染患者氣道黏液中的唾液酸化Lewis x抗原表位表達增加相一致。Magalh?es等[17]的研究也顯示幽門螺桿菌感染和胃黏膜炎癥可上調FUT3基因并增加唾液酸化Lewis a/x抗原表達。本研究同樣發現UC和CD患者腸道炎癥黏膜FUT3表達均顯著高于健康對照者。

在IBD患者的腸黏膜中可觀察到糖基化水平降低，提示黏液層缺陷可能導致細菌與上皮接觸的機會增加，從而觸發腸道炎癥反應[18]。研究發現，在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠結腸炎模型中，能維持腸道穩態、對結腸炎發揮保護作用的活化轉錄因子3(ATF3)缺失可使腸上皮巖藻糖基化水平和FUT2表達下調[19]；而給予外源性游離巖藻糖可顯著減輕模型小鼠的結腸炎癥，緩解其腹瀉、血便、體質量減輕等結腸炎癥狀[20-21]。Brazil等[22]發現，FUT3系通過催化Lewis a抗原的生物學合成介導多形核白細胞經腸上皮進入腸腔，從而促進腸道炎癥反應。本研究也關注了FUT2、FUT3表達與臨床常用IBD炎癥指標的相關性，發現CRP、FC水平升高的IBD患者FUT3表達顯著高于相應指標正常者，相關性分析顯示FUT3表達與CRP、FC之間存在一定的正相關性，表明該指標或可用于IBD的療效評估。

綜上所述，腸黏膜FUT2、FUT3表達或可成為IBD的輔助診斷和療效評估指標。本研究中FUT2、FUT3表達與IBD患者的疾病嚴重程度、病變范圍/部位、臨床表現、煙酒嗜好均無相關性，可能與樣本量有限有關。后續擬繼續增加樣本量，并對兩者表達情況進行治療前后對比，以期更精準地探索IBD患者腸黏膜FUT2、FUT3表達的臨床意義。