非小細胞肺癌中Per2的表達及其與預后的關系

池闖， 劉瑜， 林曉銘， 孫成超

（溫州醫科大學附屬第一醫院 心胸外科，浙江 溫州 325000）

晝夜節律生物鐘普遍存在于生物界，機體的生理、生化、行為過程中都表現出一定的晝夜節律變化，晝夜節律生物鐘的紊亂可能導致腫瘤的發生。流行病學研究[1-2]表明，長期夜班女性患乳腺癌的概率明顯高于正常上班人群，而長期夜班男性人群易患前列腺癌。Per2作為生物鐘基因中的關鍵組成部分，亦可能與腫瘤的發生、發展有關，在胰腺癌、神經膠質瘤等[3-4]惡性腫瘤中均存在Per2表達的降低或缺失。我們采用免疫組織化學染色法檢測非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）組織中Per2的表達，探討其在 NSCLC發生、發展和轉移過程中的作用及其與預后的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2005年1月到2006年12月在溫州醫科大學附屬第一醫院心胸外科手術治療的NSCLC病例60例，其中男38例，女22例，年齡38～77歲，≤60歲的27例，＞60歲的33例。有吸煙史37例，無吸煙史23例；中央型24例，周圍型36例；鱗癌28例，腺癌32例；高、中分化34例，低分化26例；I期14例，II期28例，III期18例；有淋巴結轉移26例，無淋巴結轉移34例。另選取同期肺大皰及肺囊腫手術中切除的正常肺組織共20例作為對照。隨訪日期以患者手術日起計算，截至2009年12月或患者死亡日期。

1.2 方法 鼠抗人Per2（M01）單克隆抗體購自ABNOVA公司；免疫組織化學SP試劑盒及其他試劑

均購自北京中杉金橋公司。組織蠟塊4μm連續切片，二甲苯脫蠟，無水乙醇逐步水化，抗原修復，SP法免疫組織化學染色，嚴格按試劑說明書進行。以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。Per2染色以細胞核或細胞質出現黃色或棕褐色顆粒為陽性。高倍鏡下隨機選10個視野，各計數100個細胞，無陽性細胞為0分，陽性細胞1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。細胞無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩分值相乘≥2分為陽性。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計學軟件進行分析。計數資料采用x2檢驗；單因素分析采用Kaplan-Meier法并繪制累積生存曲線，用Log-rank檢驗；多因素分析采用COX比例風險模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Per2在NSCLC組織和正常肺組織中的表達情況 正常肺組織中Per2的陽性表達率為95.0%（19/20），而NSCLC組織中Per2的陽性表達率為71.7%（43/60），差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。2.2 Per2的表達與NSCLC臨床病理特征的關系 Per2的陰性表達與NSCLC的分化程度及TMN分期相關（P＜0.05，見表1），而與性別、年齡、是否吸煙、病理類型、大體分型及淋巴結轉移等因素無相關性（P＞0.05）。

表1 Per2在NSCLC中的表達及其與臨床病理特征的關系

2.3 NSCLC患者預后的單因素分析 本組60例NSCLC患者中，1年生存率為83.3%，2年生存率為63.3%，3年生存率為53.3%。采用Kaplan-Meier法進行單因素分析表明患者的術后3年生存率與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況及Per2的表達狀態相關，差異有統計學意義（P＜0.05，Per2生存曲線見圖1）；而與性別、年齡、是否吸煙、病理類型、大體分型等因素無相關性（P＞0.05）。

圖1 Per2表達的NSCLC的生存曲線

2.4 NSCLC患者預后的多因素分析 將經過單因素分析篩選出來的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況及Per2的表達狀態四項臨床病理指標納入COX比例風險模型，進行多因素分析，結果顯示隨著NSCLC分化程度的降低、TNM分期的進展、淋巴結的轉移、Per2的陰性表達，患者死于肺癌的相對危險度增加，但四者均非影響NSCLC預后的獨立危險因素（P＞0.05）。見表2。

表2 NSCLC預后的多因素分析結果

3 討論

晝夜節律生物鐘是由一組呈節律表達的生物鐘基因及其相關蛋白產物作為特異核心元件組成的。哺乳動物的生物鐘基因最早發現于下丘腦視交叉上核（SCN）中，以后又逐步發現其在外周組織中也有表達，包括CKIε、Clock、Per1、Per2、Per3，Bmal 1、dbp、Rev-Erbα和Cryl、Cry2。其基本分子機制就是生物鐘基因及其蛋白產物構成的自主調節的轉錄—翻譯負反饋回路，從而形成體內精準的24 h生物鐘。Per2不但在晝夜節律的產生和維持中起著重要作用，而且在腫瘤抑制和體內DNA損傷反應中起重要作用。Fu等[5]研究發現Per2突變的小鼠與野生型小鼠相比，發生腫瘤的風險明顯增高。王雅平等[6]通過免疫組織化學的方法檢測人結直腸癌中Per2的表達發現，Per2在人結直腸癌中表達下調，且與結直腸癌患者年齡、腫瘤組織學分級、浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期相關。我們實驗發現，在正常肺組織和NSCLC組織中均有Per2的表達，但在NSCLC組織中Per2的表達明顯降低（P＜0.05）；同時，Per2在NSCLC中的表達和腫瘤分化程度及TMN分期相關（P＜0.05），即腫瘤的分化程度越低，TNM分期越晚，Per2基因蛋白陽性表達率也愈低，提示生物鐘基因Per2的陰性表達與NSCLC的發生和發展具有密切的關系。

通過病理類型和臨床分期預測NSCLC的生存期效果并不理想，因此尋找一些與肺癌有關的分子標記物作為預后指標對于完善肺癌的多學科綜合治療，提高療效具有重要意義。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、PTEN等因子[7]對NSCLC預后評估的作用已被大量實驗所證實，而關于Per2對于腫瘤預后的價值研究尚少。Per2的抗腫瘤作用主要通過調控原癌基因、抑癌基因的表達，調節細胞周期有關基因的時間性表達，抑制VEGF激動劑的活性等方式進行，其表達的下調或缺失必然會使相關的腫瘤基因失去調控而促進腫瘤的生長、轉移，影響腫瘤的預后。Filipski等[8]研究表明生物鐘基因Per2 mRNA表達被抑制后，可導致p53表達的下調和c-myc的過表達，這兩個作用都可促進腫瘤進展。Yang等[9]通過體外實驗發現，下調Per2表達會提高CyclinD、CyclinE的表達水平，使乳腺腫瘤的生長加速，使腫瘤細胞生長節奏的日振幅量成倍增加。而Per2過表達可抑制腫瘤細胞的生長，增加腫瘤細胞的凋亡率[10]。由此可見，Per2的表達狀態可能成為腫瘤預后的評價指標之一。Oshima等[11]通過檢測結腸癌患者生物鐘基因的表達情況，發現Per2的表達降低可能是結腸癌預后不良的預測因子。Relles等[3]研究發現在胰腺癌中Per2的低表達和患者的預后顯著相關，縮短患者生存時間。本研究在生存分析中通過單因素分析發現Per2的表達狀態是影響NSCLC術后3年生存率的因素（P＜0.05），Per2陰性表達患者的3年生存率明顯低于Per2陽性表達患者，我們認為Per2和NSCLC預后關系密切，在臨床上可以把Per2作為判斷NSCLC生物學行為及預后的一個評價指標。然而在多因素分析中我們發現Per2陰性表達的患者死于肺癌的相對危險度增加，但它不是NSCLC預后的獨立危險因素，說明NSCLC的預后狀況是多種因素共同作用的結果，如果將Per2和其相關因子進行聯合檢測可能能更好地揭示NSCLC的預后。同時通過檢測NSCLC中Per2的表達也有助于進一步從分子生物學水平研究其在腫瘤發生、發展中的機制，從而為肺癌的生物治療和基因治療提供新的思路。

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