3株臨床分離產OXA-232碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌的流行病學分析*

付宏煜，謝小芳，范銀銀，朱志宸，徐塑凱，杜鴻(蘇州大學附屬第二醫院檢驗科，江蘇蘇州215004)

腸桿菌科細菌對碳青霉烯耐藥主要的機制是產KPC(Ambler A類)、NDM、VIM和IMP(B類)[1]和OXA-48樣(D類)β-內酰胺酶[2]。產OXA-48樣碳青霉烯酶腸桿菌科在不同生態系統中的快速傳播給臨床帶來巨大挑戰[3]。目前已報道的OXA-48樣碳青霉烯酶包括OXA-48[4]、OXA-162[5]、OXA-181[6]、OXA-204[7]、OXA-232[8]、OXA-244[9]、OXA-245[9]、OXA-247、OXA-436、OXA-484、OXA-519。其中，OXA-232在中國最普遍[10]，與國外常見OXA-48樣酶的流行趨勢不同[11]。近年來，OXA-232樣腸桿菌科在中國開始出現[12-13]，以肺炎克雷伯菌最為常見。我國不同地區產OXA-232肺炎克雷伯菌(OXA-232-producingK.pneumoniae，OXA-232Kp)的分子流行病學特征與遺傳環境所知甚少。

OXA-232Kp的克隆性傳播多次在上海[10，14]、浙江[15]報道，尚未發現OXA-232Kp在江蘇地區的報道。本文首次調查江蘇地區臨床OXA-232Kp的流行病學特征，包括藥敏分析、耐藥基因檢測、克隆性及質粒的相關性。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年9月至2019年9月江蘇地區5家醫院(鹽城市第一人民醫院、蘇州大學附屬第二醫院、蘇州市立醫院、張家港市第一人民醫院和蘇州市吳中人民醫院)臨床連續分離的非重復碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)菌株，根據2020年美國臨床和實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)指南M100，亞胺培南、美羅培南和厄他培南最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)>2 μg/mL為耐藥，至少對其中一種藥物耐藥的肺炎克雷伯菌判定為CRKP。用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)進行菌種鑒定。質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706、大腸埃希菌J53由本實驗室保存。

1.2主要儀器與試劑 MALDI-TOF MS儀(德國Bruker公司)，Phoenix-M50全自動細菌鑒定儀及配套藥敏板卡、瓊脂糖凝膠核酸電泳儀、凝膠成像系統分析儀(美國Bio-Rad公司)，PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)，麥氏比濁儀(法國生物梅里埃公司)；胰蛋白胨、酵母提取物(美國Oxoid公司)，瓊脂粉(美國VETEC公司)，瓊脂糖凝膠粉(西班牙BIOWEST公司)，DL2000分子質量標準(日本TaKaRa公司)，美羅培南、亞胺培南(干粉，中國BIOSHARP公司)，生理鹽水、氯化鈉、異丙醇、甘油(國藥集團)，SYBR Green PCR Master Mix(美國Applied Biosystems公司)，低溫臺式高速離心機(Eppendorf Biophotometer公司)，DNA試劑盒、質粒Mini 試劑盒(OMEGA公司)，Illumina MiSeq平臺(美國Illumina公司)。

1.3藥敏試驗 用Phoenix-M50全自動細菌鑒定儀配套的革蘭陰性桿菌藥敏板測定菌株對常見抗菌藥物的MIC值。藥敏結果根據2020年CLSI-M100標準進行判讀。

1.4碳青霉烯酶表型檢測 根據2020年CLSI-M100指南，采用改良碳青霉烯酶滅活試驗(mCIM)，同時設置浸沒于無菌TSB肉湯的美羅培南抗菌藥物紙片和干燥的美羅培南抗菌藥物紙片作為空白對照；質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 和ATCC BAA-1706菌懸液的美羅培南抗菌藥物紙片分別為陽性對照和陰性對照，檢測結果根據CLSI標準判讀。

1.5耐藥基因檢測 PCR技術擴增碳青霉烯酶表型試驗陽性菌株blaOXA-48-like基因(blaOXA-232，blaOXA-48，blaOXA-181)。引物序列見文獻[16]，由上海生工公司設計合成。DNA模板制備：取分純后長出的菌落溶于100 μL的EP管中，混勻后置于100 ℃的水中煮沸15 min，取出EP管靜置冰上5 min，20 000 r/min離心2 min，取上清液1.5 μL作為DNA模板。PCR反應體系共15 μL，包括模板DNA 1.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L) 各0.75 μL，2×PCR mixture 7.5 μL，dd H2O 4.5 μL。PCR反應參數：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。將質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706作為陰性對照，擴增陽性產物由上海Sangon公司用3730xl 測序儀進行Sanger法測序。測序過程如下：醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物；使用TSR溶解純化后的PCR產物并置于95 ℃熱變性2 min；按測序儀操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠(至測序儀)和建立運行的測序順序文件；儀器自動灌膠至毛細管，1.2 kV預電泳5 min，按編程次序自動進樣，再1.2 kV預電泳20 min后，7.5 kV電泳2 h；儀器自動分析電泳結果并輸出測序序列。測序結果與 GenBank的原序列進行比對。

1.6質粒接合轉移 將待測菌株與受體菌J53的單菌落分別接種1 mL LB液中(含抗菌藥物以抑制雜菌)，置于37 ℃、250 r/min的搖床上震蕩過夜，分別以體積比1∶100轉接種于1 mL新鮮LB，培養3～4 h至對數期，將無菌濾紙片紫外照射30 min，平鋪于普通瓊脂平板上，取供、受體各100 μL混勻滴在濾紙片，37 ℃溫箱培養2 h，1 mL LB洗脫。吸取50～100 μL洗脫液均勻涂布于美羅培南和疊氮鈉的雙抗性平板，37 ℃培養過夜，通過PCR技術確定接合子是否含有目的基因，同時通過MALDI-TOF MS儀對接合子進行菌種鑒定。

1.7多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 使用文獻報道的引物序列、反應體系及反應參數[17]，PCR法擴增肺炎克雷伯菌rpoB、infB、phoE、mhd、pgi、gapA、tonB7個管家基因。擴增產物由上海Sangon公司3730xl測序儀進行Sanger法測序，測序結果與http//www．mlst．net上公布的相應等位基因序列比較，獲得該菌株7個管家基因的等位基因譜，提交 MLST網站，確定臨床分離株的序列分型(sequence type，ST)。

1.8脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE) 為確定OXA-232Kp菌株的同源性，對OXA-232Kp分離株進行限制性內切酶XbaⅠ的PFGE，如文獻[18]所述。利用Gel J軟件相似系數分析PFGE模式。PFGE圖譜中具有≥85%的遺傳相似性或少于4個片段差異的菌株被認為是同一克隆(類型)。菌株(型)與原菌株差異≤3個片段的菌株(型)認為是暴發菌株的一個亞型。

1.9質粒的提取與序列分析 質粒試劑盒提取含blaOXA-232基因的質粒菌株的質粒，Illumina MiSeq平臺測序分析，SPAdes軟件對序列拼接，通過plasmidfinder網站比對獲取質粒復制子型。

2 結果

2.1OXA-232肺炎克雷伯菌 共收集78株CRKP菌株，2株菌株(K.PN6655和K.PN6703)疑似blaOXA-48-like陽性，1株菌株(K.PN6665)疑似blaOXA-232陽性，電泳結果見圖1。將3株疑似陽性產物送上海生工測序，序列在NCBI Blast比對，結果顯示3株菌株均攜帶blaOXA-232基因。

注：A，OXA-48擴增產物電泳分析；B，OXA-232擴增產物電泳分析。K.PN6655、K.PN6703、K.PN6703，待測菌株；ATCC BAA-1706，陰性對照；M，DL 2000 marker。

2株OXA-232Kp菌株來自痰液(66.7%)，1株來自泌尿道(33.3%)，其中有2株肺炎克雷伯菌(K.PN6655和K.PN6703)來自于同一患者，但該患者在2次不同的住院期間感染肺炎克雷伯菌。3株OXA-232Kp對頭孢菌素類、氨曲南、復方磺胺甲噁唑、喹諾酮類藥物均耐藥，2名患者出院前經哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、頭孢他啶、慶大霉素等治療后恢復。

所有菌株mCIM表型呈陽性。3株OXA-232Kp可同時產超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)。所有菌株藥敏結果、基因型及臨床轉歸見表1。

表1 3株OXA-232Kp菌株的藥敏結果、基因型及臨床轉歸

MLST分析均屬于ST15型，基于Gel J分析≥85%的基因連鎖率，分離菌株屬于同一克隆，PFGE圖像見圖2。

圖2 OXA-232Kp菌株PFGE分析

2.2攜帶blaOXA-232基因的質粒周圍環境 3株菌株質粒均不能發生轉移，提示該質粒為非接合質粒。質粒測序表明，攜帶blaOXA-232基因的接合子呈現6 141 bp的質粒，屬于ColKp3型，blaOXA-232基因位于一個Tn2013-like基因轉位單元，見圖3。

注：陰影部分表示重疊區域。

Blast分析發現，該質粒與曾在中國東部報道的攜帶blaOXA-232的質粒pkNICU5(GenBank accession no.KY454616)質粒周圍環境相同。全基因組測序分析，3株菌株同時攜帶多種耐藥基因RmtF、Arr-2，攜帶rmpA2、icu1相關毒力基因位于毒力質粒上，血清分型屬KL112型，見表2。

表2 OXA-232Kp菌株的攜帶耐藥、毒力基因與血清、質粒分型

3 討論

目前，中國是世界上CRE流行較高的國家，除碳青霉烯類酶外，ESBL的產生，特別是CTX-M-15和/或AmpC的產生，以及外膜孔蛋白(OMP)的丟失，都可能導致肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥。目前已有大量文獻研究產KPC/NDM碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥特征與機制[19]。近幾年攜帶OXA-48樣碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌在中國出現，并出現院內暴發的案例[20]。

OXA-232是目前全球第3種常見的OXA-48樣碳青霉烯酶，首次報道在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中，分離的大腸埃希菌對所有β-內酰胺類(不包括亞胺培南、厄他培南和美羅培南)、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類和四環素不敏感，肺炎克雷伯菌分離株具有類似的藥敏模式，但對碳青霉烯類藥物具有耐藥性。其耐藥特征與本研究中3株OXA-232Kp菌株耐藥模式基本類似。據報道，blaOXA-232基因通常位于ISEcp1的下游Tn2013轉座元件6 141 bp的ColE型質粒上，屬于ColKP3型流行質粒，是blaOXA-232基因在全球傳播的主要原因[11]。本研究中OXA-232Kp菌株對碳青霉烯類藥物具有低水平的抗性。所有菌株攜帶blaOXA-232基因的6 141 bp ColKP3型質粒，該質粒與中國東部其他研究發現的攜帶blaOXA-232基因的質粒高度同源[14]，且無法完成接合轉移，推測是非接合質粒。全球范圍內幾乎所有攜帶blaOXA-232基因的菌株攜帶pOXA-232樣質粒(與pOXA-232高度相似或相同的質粒)。結構上除Tn2013在ISEcp1的5′端有一個大的缺失，blaOXA-232與blaOXA-181基因的遺傳環境非常相似，區別在于一個核苷酸取代(A642T)導致一個氨基酸改變(Arg214Ser)。ISEcp1轉座酶活性的缺失最有可能使blaOXA-232穩定在pOXA-232樣質粒上。迄今為止，Tn2013是唯一報道與blaOXA-232基因相關的遺傳環境的轉座子。

世界各地曾報道攜帶blaOXA-232基因的pOXA-232質粒的肺炎克雷伯菌引起的醫院暴發，與blaOXA-232相關的肺炎克雷伯菌ST15是中國常見的STs之一，例如，ST15型肺炎克雷伯菌在中國醫院重癥監護病房(ICU)和新生兒ICU病區的傳播[21]。大多數OXA-232Kp菌株共同產生CTX-M-15和NDM-1[22]。導致中國NICU暴發的OXA-232Kp(ST15型)也含有不同毒力相關基因的高毒質粒(即pLVPK樣IncHI1B/IncFIB質粒)，包括rmpA2[23]。本研究中篩選出2018—2019年江蘇地區3株ICU病區分離的OXA-232Kp，MLST分型均屬于ST15型， PFGE分析顯示同一醫院內的克隆性傳播。全基因組測序表明，3株OXA-232Kp菌株同時表達CTX-M-15與NDM，同時攜帶icuA、rmpA2等毒力相關基因，莢膜血清分型KL112型。

綜上所述，本文首次調查江蘇地區臨床OXA-232Kp(ST15型)的流行病學數據。攜帶blaOXA-232基因的質粒具有高度的同源性，表明該6 141 bp的ColE型質粒對blaOXA-232基因在中國的流行具有重要作用。