非維生素K拮抗口服抗凝藥的實驗室監測進展*

趙曉靜，門劍龍，任靜(天津醫科大學總醫院精準醫學中心，天津300052)

非維生素K拮抗口服抗凝藥(non-vitamin K antagonist oral anticoagulants，NOACs)是預防和治療血栓性疾病的常用藥物，包括達比加群酯、阿哌沙班、利伐沙班、艾多沙班等，其應用范圍覆蓋靜脈血栓、動脈血栓以及心腔內血栓(如非瓣膜房顫相關血栓)等[1]。與華法林等傳統口服抗凝藥相比，NOACs直接作用于單一靶點(凝血因子Ⅹa或Ⅱa)，不易受食物和藥物影響，藥物代謝過程穩定，抗凝效果可預測且安全性高，無需進行常規實驗監測。另一方面，在某些特定情況時，NOACs也存在一些安全性問題，其中高齡、嚴重肝腎功能不全、營養狀況不佳或胃腸道吸收不良、肥胖或體重過輕、聯合用藥等因素可引起藥物代謝異常(如藥物蓄積或清除過快)[1-2]，而在硬膜外間隙阻滯麻醉、緊急手術或溶栓治療前停藥不充分等因素可導致殘留抗凝活性過高(常引起嚴重出血)[2-3]。因此，利用實驗室監測評估NOACs的代謝情況和抗凝活性，有助于指導治療方案調整以及避免復雜臨床背景下不良事件發生。監測NOACs的主要試驗包括：液相色譜串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化的部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶時間(thrombin time，TT)和稀釋凝血酶時間(dilute thrombin time，dTT)、抗活化因子Ⅹ活性試驗(anti-FⅩa)、蝰蛇毒凝血時間(ecarin clotting time，ECT)和稀釋的蝰蛇毒時間(dilute Russell viper venom time，dRVVT)等。本文結合近年來的臨床研究證據和循證文獻綜述并評價NOACs實驗室監測的臨床應用進展。

1 液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)

LC-MS/MS是定量檢測NOACs血藥濃度的“金標準”，靈敏度高，特異性好，LC-MS/MS能測定血藥濃度范圍在1～500 ng/mL之間的達比加群酯、阿哌沙班和利伐沙班，可動態觀察血藥峰值濃度和谷值濃度，主要用于臨床研究、方法學校準和藥代動力學分析等[1-3]。國際血液學標準化理事會(International Council for Standardization in Haematology，ICSH)關于NOACs實驗室監測的文獻顯示，LC-MS/MS對NOACs有較大的檢測限范圍，其中檢測下限為0.025～3.0 ng/mL，臨床報告范圍為5～500 ng/mL，且精密度較好(批內CV<6%，批間CV<10%)[1]。Slavik等[4]研究顯示，LC-MS/MS可有效監測達比加群酯，并與dTT有良好相關性；Al-Aieshy等[5]研究顯示，LC-MS/MS可敏感反映利伐沙班血藥濃度變化(血藥峰值和谷值)，并與anti-FⅩa有良好相關性[1]；Mast等[6]研究顯示，LC-MS/MS監測阿哌沙班時與anti-FⅩa有很強的相關性(但二者在峰值濃度出現的時間點上略有差異)；Harenberg等[7]多中心研究顯示，LC-MS/MS測定尿液樣本中阿哌沙班、艾多沙班和利伐沙班的靈敏度、特異性均≥95%，達比加群酯>97.5%。總體而言，LC-MS/MS適用于血、尿等臨床樣本，能有效評估血藥濃度的變化，幫助醫生識別藥代動力學異常[5]。此外，LC-MS/MS也可用于包括司法鑒定樣本，Wiesen等[8]利用LC-MS/MS對死亡個體的心臟血液、股骨血液、腦脊液和尿液中NOACs進行檢測并獲得準確的定量結果。另一方面，LC-MS/MS雖然能準確測定血藥濃度，但并不能直觀反映NOACs在患者循環血液中產生的抗凝活性(有效性)以及對機體止血能力的影響(安全性)[1,9]。因此，評估NOACs藥代動力學和藥效學之間的關系，需聯合功能試驗(如APTT、PT、dTT等)和臨床表現做總體評估。此外，由于LC-MS/MS技術相對復雜，設備較為昂貴，操作步驟繁瑣，也使該技術尚未能普及應用于臨床。

2 凝血酶原時間(PT)

治療劑量的NOACs可影響PT結果，而且多數類型的PT試劑對利伐沙班和艾多沙班的敏感性均高于阿哌沙班[10]。120～290 ng/mL的利伐沙班[11]和97～296 ng/mL的艾多沙班[12]可劑量依賴性延長PT(線性關系較弱)，當PT延長至2倍以上，提示有潛在出血風險[1-2,13]。利伐沙班是目前應用較為廣泛的NOACs，PT的合理使用，對該藥物在臨床應用的安全性和有效性具有重要意義。Woodruff等[14]研究顯示，PT能有效反映住院患者利伐沙班給藥后的出血風險及藥效學特征，PT≥30 s的患者的出血事件總發生率(38.7%)顯著高于PT<30 s的患者(17.3%)；多變量回歸模型顯示，PT≥30 s患者的出血風險優勢比(odds ratio，OR)為3.25(95%CI：1.09～9.66)。近年來，更多的研究證實了根據藥代動力學特征選擇監測PT的時間點有助于評估患者藥物使用的有效性和安全性。Suzuki等[15]評估了5種PT試劑對利伐沙班治療后的峰值(給藥后2～4 h)和谷值(下一次給藥前)的監測效果，并采用非線性混合效應模型對藥代動力學和藥效學進行建模，結果顯示這些PT試驗對利伐沙班藥代動力學傾向具有中等預測能力。另一種NOACs——艾多沙班，與利伐沙班的體外試驗特征非常相近[16]。因此，在臨床上PT還可用于監測艾多沙班。Iba等[17]研究顯示，艾多沙班血藥濃度為0～>300 ng/mL的臨床樣本中，PT與anti-FⅩa活性呈正相關(尤其是血藥峰值水平時)，并且與凝血酶原復合物濃縮物的逆轉效應呈劑量依賴性。Parasrampuria等[18]研究顯示，PT可有效反映艾多沙班的藥代動力學和抗凝效應，艾多沙班給藥4 d后，峰值PT為(21.8±2.46)s，與從利伐沙班或達比加群酯切換到艾多沙班后的峰值水平(21.8±2.88)s相近。Sezai等[19]研究顯示，PT是監測心臟手術后心房顫動患者實施艾多沙班治療有效性和安全性的可靠手段。需注意，雖然PT有助于監測利伐沙班和艾多沙班出血風險，但不能精確反映其抗凝活性(PT延長與血藥濃度相關性弱[20-22])，僅可作為評估安全性的初篩手段，不能用于指導藥物劑量調整[1,13]。

PT對治療劑量的阿哌沙班(200 ng/mL)不敏感[9]，當PT延長達到2倍水平，所對應的血藥濃度分布范圍非常大(480～1 000 ng/mL)[1]。因此，PT不能反映阿哌沙班的安全性和有效性。此外，達比加群酯也會造成PT延長，但由于PT與達比加群酯的劑量關聯性更差，無法反映其抗凝活性的變化。因此，PT不能進行有效監測。

利用PT監測利伐沙班和艾多沙班的注意事項包括：(1)需使用對血藥濃度變化相對敏感的PT檢測系統[20-22]；(2)以“s”作為PT測定值的表達方式優于國際標準化比值(INR)[1,13]；(3)在血藥濃度處于峰值時檢測用于評估藥物療效，在谷值時檢測用于評估安全性[1-2,13,23](在評估出血風險時，谷值效果優于峰值)[3,9,14]，但任意時間PT出現>2倍延長都提示潛在出血風險。

3 活化的部分凝血活酶時間(APTT)

NOACs在治療劑量時可使APTT出現不同程度的延長，其中APTT與利伐沙班、艾多沙班、阿哌沙班的劑量相關性差，因此不宜用于此類藥物的監測[2-3,13]。既往研究證實，血中達比加群濃度與APTT呈劑量依賴性延長(非線性相關)[23]，血藥濃度為100 ng/mL和200 ng/mL時，可使APTT延長至參考區間上限的1.43～1.71倍和1.67～1.97倍[2,13]。達比加群酯用藥后，血藥濃度可在2 h左右達峰，APTT多延長2倍左右，>2倍則提示潛在出血風險[1-2,22]；當血藥濃度處于200～400 ng/mL，APTT可延長>2倍，但與血藥濃度的相關性進一步弱化；當血藥濃度>400 ng/mL時，APTT與血藥濃度無相關性(不再進一步延長)，也無助于評估出血風險[24-25]。法國圍手術期止血工作組(GIHP)建議，對于接受達比加群酯治療的圍手術期患者，如無法測定達比加群血藥濃度，可采用APTT比值≤1.20為安全標準。

利用APTT監測達比加群酯的注意事項包括：(1)對藥物濃度敏感性高的APTT更有助于評估安全性(一些不敏感的APTT試劑，無法安全排除血中殘留的達比加群抗凝效應[26-27])；(2)基于APTT與血藥濃度的關聯性特征，APTT可評估給藥劑量為100 mg(每日2次)的達比加群酯的安全性和有效性，而對于150 mg(每日2次)達比加群酯，僅可評估有效性[1,25]。

4 凝血酶時間(TT)和稀釋的凝血酶時間(dTT)

TT對血中達比加群有高度敏感性，治療劑量的達比加群酯可使TT延長至300 s以上，即使血藥濃度接近谷值水平也常出現TT明顯延長的現象(>100 s)。Solms等[23]研究顯示，TT在達比加群血藥濃度為42 ng/mL和182 ng/mL時，分別延長7.6倍或15.4倍。如患者停用達比加群酯后TT仍延長，則提示患者血液中殘留達比加群抗凝活性[2-3]。由于TT對達比加群過度敏感，導致其與血藥濃度無明確劑量相關性，且在治療水平時TT幾乎都會超出實驗檢測限的范圍，因此無法評價達比加群酯的安全性和有效性[1,25]。另一方面，TT對達比加群酯敏感，對阿哌沙班、艾多沙班或利伐沙班不敏感[26]，而且正常水平的TT對排除達比加群的特異性為100%[27]，因此TT可作為達比加群血藥濃度是否>30 ng/mL的陰性預測手段。

dTT是在TT基礎上的改進方法，由于TT對患者血中達比加群過于敏感，因此dTT在檢測前首先對患者血液樣本進行稀釋(通常用健康人混合血漿以1∶8進行稀釋)，根據給藥劑量或預期血藥濃度，標本稀釋比例最大可調整為1∶20。dTT與50～500 ng/mL之間的達比加群顯著相關并能定量推導出血藥濃度，當血中達比加群>200 ng/mL則提示潛在出血風險[1-2]。Slavik等[4]研究顯示，與LC-MS/MS相比，dTT由于使用了非線性校準曲線，因此在較大血藥濃度范圍內(尤其是低濃度水平)顯示出良好的分析效果，可作為達比加群酯的定量監測方法。需注意，各種dTT檢測體系對達比加群敏感性不一，需使用特定校準品和對照品做性能驗證[28]。

5 抗活化因子Ⅹ活性試驗

基于發色底物法的抗活化因子Ⅹ活性(anti-FⅩa)試驗的檢測原理是FⅩa被肝素-抗凝血酶復合物中和后，殘余FⅩa用顯色底物定量。由于華法林、枸櫞酸鈉、狼瘡抗凝物、Ⅷ因子活性升高和肝病等因素對anti-FⅩa幾乎不產生影響，因此anti-FⅩa更為可靠[1-2,29-30]。

anti-FⅩa與治療劑量的阿哌沙班[6]、利伐沙班[13]和艾多沙班[31]血藥濃度呈線性相關，且與LC-MS/MS檢測結果有良好相關性(顯著優于PT)[4,32]，可定量推導出血藥濃度。利用anti-FⅩa能動態觀察血藥峰值濃度和谷值濃度的變化趨勢，評估患者藥代動力學特征[1,13]，幫助醫生預判抗凝過度(如劑量過大)或不足(如劑量過小或聯合藥物干擾)以及出血風險(尤其是藥物蓄積)。近年數據顯示，血藥濃度<30 ng/mL是服用利伐沙班在術前停藥、溶栓前停藥的安全閾值，緊急手術或有創檢查患者停藥后如血藥濃度>30 ng/mL時應進行逆轉干預，>100 ng/mL是溶栓治療的禁忌[33-34]。需注意，擇期手術前停用利伐沙班≥3 d，血藥濃度通常降至30 ng/mL以下，如患者應用抗心律失常藥物或有中度以上腎損害，停藥時間應充分(不少于3 d)[35]。Ikeda等[36]研究顯示，anti-FⅩa測定可能有助于評估高危患者(如高齡、低體重和/或腎功能損害)的藥效學異常；峰值時，服用利伐沙班或阿哌沙班患者的anti-FⅩa活性幾乎相同，谷值時，服用利伐沙班的患者anti-FⅩa活性低于接受阿哌沙班患者。法國GIHP建議，接受利伐沙班的圍手術期治療患者，以≤30 ng/mL為安全性臨界值[37]，而阿哌沙班和艾多沙班由于出血風險更低，目前尚未明確安全性臨界值。

利用anti-FⅩa監測上述Ⅹa因子抑制劑的注意事項包括：(1)anti-FⅩa實驗原理應為發色底物法，以確保測定結果不被試劑成分干擾[38]；(2)血藥峰值濃度反映有效性(抗凝活性)，谷值濃度反映安全性(出血風險)；(3)檢測不同Ⅹa因子抑制劑時，需采用相應的標準品對anti-FⅩa進行校準；(4)由于檢測精度的限制，anti-FⅩa無法準確定量檢測血中<15 ng/mL的阿哌沙班[39]、<30 ng/mL的利伐沙班[40]和<30 ng/mL的艾多沙班[1]；(5)評價血藥濃度臨床意義時，需結合PT、年齡、胃腸道功能、聯合用藥、臨床表現等情況做綜合分析。

6 蝰蛇毒凝血時間(ECT)

ECT的實驗原理是試劑中的蝰蛇毒成分(一種金屬蛋白酶)剪切凝血酶原(Ⅱ因子)肽片段并使之活化，此過程的中間產物活性被達比加群所抑制[41]，其抑制程度與達比加群血藥濃度呈線性相關(劑量依賴性)[42]，可用于評估達比加群酯的安全性和有效性。ECT與質譜檢測結果有良好的相關性，50～500 ng/mL為其最佳檢測限范圍。ECT延長至正常上限>3倍提示有潛在出血風險。此外，由于ECT對肝素類藥物不敏感，在達比加群酯與肝素類藥物橋接時，對ECT的特異性較其他試驗更強[28]。

利用ECT監測達比加群酯的注意事項包括：(1)在血藥濃度<40 ng/mL或> 940 ng/mL時檢測性能下降[13,41](當血藥濃度過高時，可用健康人混合血漿按1∶1比例稀釋患者血漿)；(2)低纖維蛋白原血癥或凝血酶原缺乏影響試驗準確性[41]；(3)不同ECT檢測體系間無統一標準(尤其是蝰蛇毒試劑濃度)，檢測前需利用標準品進行校準。

7 稀釋的蝰蛇毒時間(dRVVT)

dRVVT是用于檢測狼瘡抗凝物的凝血試驗，而抗凝藥物一直以來被視為導致dRVVT結果不可靠的臨床因素。研究顯示，dRVVT對NOACs有濃度依賴性影響[43]，即使NOACs血藥濃度處于谷值水平，dRVVT檢測中假陽性發生率也高得驚人[44]。

臨床實踐發現，不同NOACs對dRVVT試驗的影響存在顯著差異，如dRVVT對血藥濃度較低的達比加群非常敏感，dRVVT標準化比值呈劑量依賴性，且與出血風險相關[43]；此外，dRVVT與anti-FⅩa測定血漿濃度有一定關聯性[45]，其中<100 ng/mL的利伐沙班和<70 ng/mL的阿哌沙班對dRVVT確認試驗有較弱的影響[43]。Ratzinger等[44]研究顯示，與不含NOACs的血漿標本比較，達比加群血漿濃度>12.5 ng/mL時，即可造成dRVVT明顯延長，使dRVVT確認實驗假陽性率達43.3%；利伐沙班血漿濃度>7.5 ng/mL時，會全面影響dRVVT的篩選試驗和確認試驗，其中30.0%的確認試驗顯示假陽性；阿哌沙班血漿濃度>18.75 ng/mL時，確認試驗明顯延長，假陽性率達20.7%，與其他NOACs相比，阿哌沙班對dRVVT比值的影響與藥物劑量無依賴性。Favaloro等[46]對7 170例結果進行了分析，發現幾乎所有NOACs都可導致dRVVT篩選試驗和確認試驗的延長，其中利伐沙班對篩選試驗的影響大于確認試驗，導致dRVVT比值較高(假陽性)，而阿哌沙班對確認試驗的影響大于篩選試驗，甚至可能導致dRVVT比值較低(假陰性)。Reda等[47]研究顯示，dRVVT標準化比值與利伐沙班相關，與阿哌沙班血漿水平無關。總體而言，基于dRVVT對較低水平的NOACs有較高的敏感性，未來有可能成為急診室或在緊急情況下[45]快速評估患者潛在出血風險的有效方法(尤其是利伐沙班和達比加群酯)。

8 結語

隨著NOACs在臨床上應用范圍日益廣泛，其在復雜臨床情況下的藥物代謝以及藥效學不穩定現象頻繁發生，進而引發各種出血和血栓復發等不良事件，人們開始意識到，構建有效的實驗室評估體系是提高抗凝治療安全性和有效性的關鍵。由于質譜技術尚不能普及，基于功能試驗的檢測手段仍將長期作為監測NOACs的主要方法，但目前仍有一些亟待解決問題。首先，基于患者個體特征、合并癥與治療因素疊加現象，需進一步細化檢測指征分類，以提高監測的針對性和結果分析的可靠性；其次，根據本機構NOACs的類型和劑型，應完善實驗方法學標準化體系(尤其是校準曲線)，避免錯誤使用試驗(如將低分子肝素的anti-FⅩa監測利伐沙班，或將利伐沙班的anti-FⅩa監測阿哌沙班)；再次，針對不同臨床問題，構建對應的臨界值評價體系，以指導醫生針對性調整藥物。隨著人類社會預期壽命的不斷延長，血栓性疾病日益成為主要的健康威脅，而抗凝治療則是血栓防治的基石，預期在多學科聯合的基礎上，未來抗凝監測領域將會有更多的回顧性和前瞻性隊列研究、隨機對照試驗以及系統評價和薈萃分析，為臨床實踐提供更為堅實的循證依據。