人體呼出氣的分析研究與臨床應用進展*

陳然然，宋珍華，吳德華，龍成生，張劉睿祺(公安部南京警犬研究所氣味物證實驗室，南京210012)

人體呼吸分為吸氣和呼氣過程，吸氣使外部環境空氣與肺泡內血液空氣屏障處的內部環境交換，外源性化合物擴散到血液后幾乎與人體的每個組織接觸；呼氣過程中，外源性化合物和反映內部身體狀況的內源性化合物從血液擴散到呼吸中，通過呼氣排出體外。人體的呼出氣主要包括氮氣、氧氣、二氧化碳、水蒸氣、惰性氣體和數千種微量揮發性有機化合物(VOC)和無機分子(例如NO、NH3和CO等)。在人體呼出氣中已鑒定出近3 500種揮發性有機化合物[1]，其是人體中持續發生的代謝、分解代謝和外源性暴露過程的產物，大多數物質都是外源性的，源于環境污染物吸入、食物攝入、皮膚接觸和藥物代謝等，可反映外界因素對人體健康的影響；來源于人體生理和病理反應隨著呼出氣體而排出體外的代謝產物VOC包含豐富的生物特征信息，呼吸可作為代謝組學的媒介，呼吸代謝組學可以深入了解人體的所有代謝過程，提供更加全面的身體狀況信息。通過呼出氣分析可以檢測人體呼出氣中的代謝產物并監控其變化，用以人體的健康狀況評估以及疾病診斷。

人體代謝產物(如VOC)通過血液到達肺部，在肺部進行物質交換后通過呼吸道以呼出氣的方式排出體外，人體代謝的異常會導致呼出氣中某些成分的變化，進而可通過呼出氣診斷的方法來分析判斷病情[2]。人體呼出氣中的VOC可以揭示各種人體健康狀況，相比于傳統有創取血檢測，呼出氣分析診斷具有無創、快速、準確等優點。利用呼出氣診斷人體疾病可追溯到古希臘時期，現代呼出氣分析研究始于Pauling等[3]通過氣相色譜法從人體呼出氣中檢測到約250種VOC。呼出氣中VOC的一種或多種與特定疾病有關，這些VOC被稱為疾病的生物標志物(biomarker)。近年來，呼出氣分析廣泛應用于疾病生物標志物的研究，并發現呼出氣中VOC種類和水平的變化與多種疾病存在關聯，如糖尿病患者呼出氣中異戊二烯、二甲基硫醚、硝酸甲酯、丙酮、丁醇以及一些長鏈烷烴和苯系物的水平異常[4]；戊烷、苯、苯乙烯、丙醇等均被識別為肺癌的可能標志物[5]；庚酮、戊酮、乙烷、戊烷等被證明與慢性阻塞性肺疾病(COPD)存在顯著關聯[6]。

目前，呼出氣分析在疾病初篩和早期識別中的應用越發受到關注，越來越多的研究證實了呼出氣分析在臨床診斷、健康監測和環境中VOC暴露評估輔助方面的準確性與重要性。臨床和實驗室針對人體呼出氣的分析研究，主要是檢測新技術的研發和疾病生物標志物的發現。人體呼出氣通過采氣袋、不銹鋼容器和吸附捕集器等采集后，或通過固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)[7]或熱脫附(thermal desorption,TD)[8]進行預濃縮和富集后，采用基于氣相色譜(gas chromatography, GC)或質譜(mass spectrum,MS)、激光光譜和氣體傳感器的方法進行檢測分析[9]。此外，也開展了使用訓練有素的嗅探犬進行癌癥識別篩查的研究[10]。

目前尚未有關于呼出氣中VOC采集、檢測、分析、數據處理等標準化操作流程。本文重點綜述了人體呼出氣的采集及分析技術、呼出氣中存在的疾病生物標志物、呼出氣分析的臨床應用等方面的研究進展，為進一步研究人體呼出氣成分、呼出氣用于臨床診斷和健康監測、呼出氣成分與各種疾病的關系等提供借鑒，推動人體呼出氣的分析研究進展。

1 呼出氣的采集與儲存

呼出氣的采集和儲存應注意保存高揮發性的疾病生物標志物、避免環境VOC的污染，然而，目前人體呼出氣的分析研究中缺乏對呼出氣采集和分析的標準化。標準有效的采樣程序在呼出氣分析的科學研究以及臨床應用中起著關鍵作用，其必須考慮兩個方面，目標呼出氣是總呼吸(生理死腔氣和肺泡氣)還是肺泡氣，及其采樣方式[9]。總呼吸采集簡單，無需額外設備，但是生理死腔氣會稀釋呼出氣中生物標志物的濃度；肺泡氣中外源性污染物濃度較低，其內源性VOC的濃度比總呼吸中高2～3倍[11]。健康個體一次能呼出半升或更多的氣體，最初的150 mL是呼吸道的死腔氣，沒有在肺泡中進行交換，采集呼出氣時可除去呼吸的前半部分，以減少死角空氣對肺泡空氣的稀釋和污染[12]。

呼出氣采樣分為直接和間接兩種方式，直接采樣為呼出氣直接被引入測量系統，間接采樣為呼出氣存儲在一定的介質中或經過預濃縮處理后進行分析。常用的呼出氣采集儲存介質包括：采氣袋(如Tedlar采氣袋、Mylar采氣袋、Flexfoil采氣袋、Nalophan采氣袋等)、化學惰性和低放射性塑料材質容器(如注射器等)、玻璃瓶以及裝有吸附劑的不銹鋼容器和玻璃管(吸附捕集器)，其中Tedlar采氣袋、注射器和吸附捕集器應用最為廣泛[13]。

通常采用吸附捕集器與采氣袋相結合的方式進行呼出氣的采集與儲存，瑞士杜爾滕生態醫療中心采集呼吸肺泡氣的設備示意圖如圖1所示[14]，該設備通過肺沖洗來清除呼吸過程中吸入的環境污染物使樣本污染最小化，自動將呼吸死角空氣填充到相應的采氣袋中，該袋隨后被移除，然后收集肺部的肺泡氣，肺泡氣儲存在惰性氣袋或容器中，也可直接轉移到分析儀器中，該呼氣采集系統已用于多項研究[15-16]。

圖1 呼出氣收集設備示例[14]

王彤等[17]研究肺隱球病患者呼出氣中特征揮發性有機物時，樣本采集方式如圖2所示，采用鼻吸口呼的方式深呼吸3次，然后用鼻子深吸一口氣并屏息10 s后開始吹氣，呼出氣中的前半段(約5 s)將管路中的廢氣吹出，后半段(約5 s)采集至1 mL的定量環中，隨后進入檢測器。此外，謝少華等[18]研究呼出氣中VOC對<50歲人群肺結節良惡性的預測價值時，通過采氣筒收集口腔呼出氣到Tedlar采氣袋，并將裝有呼出氣的Tedlar采氣袋置于2～8 ℃下轉運，未能及時分析檢測時，置于-40 ℃冰箱中保存，并于一周內完成檢測。

圖2 人體呼氣采集示意圖[17]

2 呼出氣檢測技術

呼出氣分析作為一種無創且快速的可提供人體疾病狀態和治療結果反饋的測試方法，雖然處于起步階段，但已引起了科學界和臨床醫學界越來越多的關注。目前，呼出氣分析檢測方法主要包括基于GC或MS、激光光譜以及各種氣體傳感器和氣體傳感器陣列(電子鼻系統)的方法[9]，對于呼出氣中VOC的檢測，通常需要基于氣體傳感器的方法與大型儀器設備相結合來實現對混合VOC中多種成分的同時檢測，陳星等[19]構建的基于氣相色譜-聲表面波傳感器聯用的中醫聞診系統，通過檢測呼出氣中的VOC來辨識中醫脾胃癥候，其集成了大型設備與傳感器的優點，氣體傳感器體積小、能耗低、響應速度快、成本低，可實現現場實時的動態監測，雖然大型儀器設備無法實現現場實時的動態監測，但是能夠更準確的檢測出混合氣體的成分。

2.1基于GC、MS的檢測技術 GC用于呼出氣中痕量化合物分析時，常與MS、離子遷移譜(ion mobility spectroscopy，IMS)耦合使用[12]。此外，質子轉移反應質譜(proton transfer reaction mass spectrometry，PTR-MS)和選擇離子流動管質譜(selected ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS)可用于呼吸中痕量氣體的實時定量測量[9]。GC-MS技術是檢測呼出氣中VOC的金標準，尤其是用于疾病生物標志物的全面研究和鑒定，能夠定性和定量表征呼出氣中與人類疾病相關的生物標志物[20-21]，但是GC-MS和類似分析儀器在臨床診斷中的適用性有限。IMS與GC多維色譜柱的耦合可以直接測量人體呼出氣中的VOC，具有靈敏度高、分析成本低和數據采集速率高等優點，檢測限低，適合臨床診斷[17]。PTR-MS技術靈敏度高、相應速度快、可頻繁快速測量、檢測物質濃度低至ppb，不需要預濃縮和分離程序，在檢測VOC方面具有很大的優勢[22]；但是該技術只能檢測質子親和力高于水的質子親和力的化合物，并且無法區分同分異構和同量異位離子，因為它們都是在相同的標稱質量下檢測到的。SIFT-MS將快速流管技術與質譜定量分析相結合，已被開發用于實時檢測和定量分析呼吸樣品中的痕量氣體[23]，其分析呼出氣樣品時無需將呼出氣收集到袋中或收集器上，可以直接分析單次呼出氣，為臨床監測提供即時結果。各種檢測技術在呼出氣分析研究中的應用如表1所示。

表1 基于GC、MS的檢測技術在呼出氣分析中的應用

2.2基于激光光譜的檢測技術 相比于質譜檢測，激光光譜檢測技術具有高靈敏度、高選擇性、實時響應、儀器成本相對低等優點，主要包括可調諧二極管激光吸收光譜(tunable diode-laser absorption spectroscopy，TDLAS)、光腔衰蕩光譜(cavity ring-down spectroscopy，CRDS)和光聲光譜(photo acoustic spectroscopy，PAS)等，在實驗室研究中可以利用激光光譜技術檢測呼出氣中的生物標志物，但因激光光源成本高、體積大和使用環境等因素限制了家庭使用[9]，基于激光光譜的檢測技術在呼出氣分析研究中的應用見表2。

表2 基于激光光譜的檢測技術在呼出氣分析研究中的應用

2.3基于氣體傳感器的檢測技術 氣體傳感器是目標氣體與傳感器材料發生吸附或氧化還原等反應，引起傳感器材料某些性質發生變化，通過監測響應信號的變化對樣本中目標氣體進行定性定量分析的小型化裝置[35]。相比于實驗室大型儀器設備，氣體傳感器具有的可開發性、測試成本低和小巧易操作等優勢，使其在顯著降低醫療成本、人體健康監控和環境質量監控等方面具有極大的潛力，此外，針對可穿戴式氣體傳感器已開展了大量研究，并廣泛應用于醫療保健、感官模擬和機器人中[36]。目前氣體傳感器主要包括比色法傳感器、金屬氧化物傳感器、基于納米材料的碳納米管傳感器和納米金屬氧化物傳感器以及基于半選擇性交互式傳感器陣列組成的電子鼻系統[9]。比色法傳感器可用于指示環境中VOC是否達到允許暴露的濃度限制、是否達到威脅生命和健康的濃度以及顯示醫療診斷中的呼吸測試結果等，適于羧酸類、醇類和酯類等活性強的VOC測量，對于芳香烴、氯烴等穩定性強且濃度低的VOC檢測較難[10]。金屬氧化物傳感器具有制造工藝簡單成熟、成本低、功耗小、可大量生產和高度小型化等優點，但用于呼出氣傳感器的金屬氧化物存在導電性低、響應和恢復動力學緩慢、目標選擇性較弱以及較高的工作溫度等缺陷[9,37]。碳納米管氣體傳感器對大量的氣相分析物均具有敏感性，如NO2、NH3、CH4和H2S等，具有響應速度快、體積小、靈敏度高以及可在室溫下工作等優點，在醫學界的應用具有廣闊的發展前景[9]。將氣體傳感器陣列與模式識別技術相結合即形成類似生物嗅覺的電子鼻系統[9]，其在多種疾病的(如肺癌、多發性硬化癥和慢性腎病)呼出氣測試中已使用電子鼻系統[38]。基于各類氣體傳感器的檢測技術在呼出氣分析研究中的應用如表3所示。

表3 基于傳感器的檢測技術在呼出氣分析研究中的應用

3 呼出氣中與疾病相關的生物標志物

呼吸維持著人體的正常生理活動，人體呼出氣中的VOC很多來自于人體內源性的生理和病理反應，呼出氣中的一種或多種VOC與特定疾病有關，這些VOC被稱為疾病的生物標志物(biomarker)。在醫學診斷中被識別為潛在生物標志物的內源性VOC主要包括碳氫化合物(如乙烷、戊烷和異戊二烯等)、含氧化合物(如丙酮、乙醛和甲醇等)、含硫化合物(如二甲基硫醚、甲基硫醇和乙硫醇等)和含氮化合物(如氨、二甲胺和三甲胺等)等，表4中列出了一些與疾病相關的呼出氣組分。

表4 與某些疾病相關的呼出氣生物標志物

4 人體呼出氣在健康監測及疾病診斷方面的應用

4.1碳呼氣試驗13C呼氣試驗是檢測幽門螺桿菌(helicobacter pylori,HP)感染的金標準。高慧芳等[53]研究結果表明，14C呼氣試驗檢測Hp感染可以比較準確地了解消化道疾病患者的病情情況，有利于疾病進一步的治療。

王文雅等[54]探討了健康體檢人群13C呼氣試驗結果與血清胃蛋白酶原水平的相關性，結果顯示兩者具有一定相關性，在進一步研究基礎上，未來部分人群可以僅通過其中一種方法完成健康人群體檢篩查。夏倫文等[55]研究表明，14C呼氣試驗聯合胃泌素-17(gastrin-17,G-17)、胃蛋白酶原Ⅰ(pepsinogen-Ⅰ,PG-Ⅰ)、胃蛋白酶原Ⅱ(pepsinogen-Ⅱ,PG-Ⅱ)、PG-Ⅰ與PG-Ⅱ比值(PGⅠand PGⅡ ratio,PGR)對健康體檢人群胃息肉具有輔助診斷價值。

白穎等[56]研究表明，呼氣試驗在胃排空延遲中有較高診斷價值。口服與食物結合的同位素13C，通過檢測不同時段13C含量可間接反映胃腸道動力情況。1993年，Ghoos等[57]首先報道了應用13C辛酸呼氣試驗診斷胃排空延遲的方法，至今在診斷消化系統疾病中已運用數十年。

賴慎偉等[58]研究表明，G-17及14C呼氣試驗檢測對胃癌早期診斷具有較高參考價值，可利于及早采取針對性治療。此外，吳峰等[59]研究表明，14C呼氣試驗聯合G-17、PGⅠ、PGⅡ檢測在早期胃癌篩查中具有重要意義，可為胃癌早期診斷提供有效依據。

4.2呼氣末CO2分壓監測 呼氣末CO2是一項可表征人體肺部通氣、代謝狀態和循環功能等情況的非常重要的生理參數，也是臨床檢查的重要指標。呼氣末呼出氣中CO2的濃度即呼氣末二氧化碳分壓(PetCO2)，其與動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)有一定的相關性，監測PetCO2可用于評估心肺復蘇質量、輔助呼吸內科疾病診斷與療效評估、麻醉監護等，是一種直觀、操作簡單快捷的無創監測技術。美國麻醉師協會(ASA)、美國呼吸治療協會(AARC)及美國心臟協會(AHA)均將CO2監測作為一種常規的監測項目。

AHA心肺復蘇指南指出，PetCO2可反映心臟驟停患者實施心肺復蘇過程中的心排血量和心肌灌注，用以優化胸外按壓質量及指導血管加壓藥物治療。研究表明，COPD、哮喘和肺炎等患者呼出氣中CO2的含量與健康個體差異較大[60]。PetCO2可以用來排除肺栓塞[61]和評估COPD患者的呼吸衰竭程度[62]，在COPD患者加重期，PetCO2與PaCO2的差值(ADCO2)是評價病情嚴重程度的有效指標。ASA推薦手術過程中常規監測PetCO2來指導通氣量的調節，如連續監測PetCO2在及早發現新生兒急腹癥手術靜脈麻醉過程中呼吸功能變化時具有很高的可信度和準確度。

4.3呼氣峰流速監測 呼氣峰流速(peak expiratory flow,PEF)是指研究對象從用力吸氣到不能再吸入的位置(被稱為肺總量)開始用力呼氣過程中，最初100毫秒所能達到的最高呼氣流速(量)。PEF監測是一種簡易的肺功能檢測手段，能夠反映呼吸道氣流阻塞的程度，可用來預測哮喘急性發作、評估藥物療效及急性加重后的恢復情況。陳春雨等[63]探索了肺癌患者肺葉切除術前PEF對術后肺部相關并發癥(PPC)的臨床預測價值，結果表明低PEF值與肺癌患者肺葉切除術后PPC的發生有關，是PPC的獨立預測因子。研究表明，心血管疾病風險及其相關發病率和死亡率與肺功能的減退和PEF的減退相關；國外研究發現，PEF可預測個體未來的住院率和死亡率，可作為評估個體健康狀況及風險預測的工具[64]；國內研究發現，PEF與呼吸系統疾病、心血管疾病和肺癌死亡率呈負相關[65]。研究表明，可以將PEF指標納入China-PAR預測10年心血管疾病患病風險公式中，進一步篩查心血管疾病高危人群[66]。

4.4嗅探犬用于癌癥識別 犬有可能發現癌癥的報道分別發表于1989年[67]和2001年[68]，未經訓練的犬自發識別到其主人身上的惡性黑色素瘤。從此，一些研究中心針對這方面開展了研究和測試，試圖通過訓練有素的犬嗅聞人體組織、尿液或呼出氣等不同檢材，來識別不同類型的癌癥(如肺癌、卵巢癌和結腸癌等)。

近年來，開展了大量利用訓練有素的嗅探犬識別人體呼出氣中癌癥的生物標志物，Rudnicka等[25]使用訓練有素的嗅探犬識別肺癌患者、健康志愿者和其他肺部疾病患者的呼出氣，并與采用SPME/GC-MS技術對這些呼出氣樣本定性和定量結果進行比較，來評估嗅探犬氣味檢測的敏感性和特異性，結果顯示，犬針對這些呼出氣樣本檢測的敏感性為86%、特異性為72%。因此，將來使用嗅探犬進行氣味檢測有可能實現快速、無痛且無創的癌癥診斷。

Jezierski等[69]研究表明，訓練有素的犬能夠以“比偶然性好”的概率區分出肺癌和其他癌癥患者的典型呼吸氣味樣本與健康人的典型呼吸氣味樣本，犬檢測的適應性與呼吸氣味樣本中2-戊酮和乙酸乙酯的含量呈正相關，與1-丙醇和丙醛的含量呈負相關。此外，McCulloch等[70]研究表明呼出氣樣本儲存幾周后，嗅探犬仍能區分癌癥患者和健康志愿者的呼出氣樣本。

犬氣味鑒別作為潛在的癌癥篩查方法，具有無創性、呼出氣采樣和儲存簡單、易于檢測和結果簡單明了以及檢測成本較低等優勢，但是該方法不能確定犬對呼出氣中哪種或哪些物質反應，尚不能確定嗅探犬是否能以與嗅出已經確診病例大致相同的準確度嗅出臨床癌癥早期。為了實現利用犬在人群中進行實際的癌癥篩查，必須通過大量的實驗來評估，利用犬區分出確診的癌癥病例與健康人的呼出氣樣本并不是最終目標，未來利用嗅探犬進行癌癥篩查和預防對人類具有重要的意義。

5 展望

人體呼出氣中包含豐富的生理和疾病的生物特征信息，呼出氣組分的檢測有助于深入了解人體內的所有代謝過程，提供生物體狀況的全面信息用于健康評估，以及依據生物標志物進行疾病診斷。目前，已發現人體呼出氣中包含多種疾病的生物標志物，如肺癌、乳腺癌和糖尿病等，然而針對各種生物標志物的來源、分布和生化途徑的研究仍處于初步階段，其與疾病的確切關聯性尚不清楚；同時不同個體之間特定VOC的差異取決于各種因素，如生理狀態、飲食習慣、呼出氣采集及儲存方式方法、檢測技術和操作人員造成的各種誤差等，尚未發現某種VOC只與一種疾病有關聯。總的來說，目前尚未有關于呼出氣中VOC采集、檢測、分析、數據處理等標準化操作流程，未來我們可逐步實現呼出氣采集和分析的標準化，推進呼出氣分析在人體健康監控、疾病診斷和環境VOC暴露風險等方面的應用進程。此外，針對呼出氣中疾病生物標志物的研究，仍需進行大量研究、增加樣本量、提高分析儀器靈敏度，以獲得更加準確的呼出氣VOC表征，找出呼出氣中更加確切的疾病生物標志物。

目前，科學界和臨床醫學界針對呼出氣的研究主要疾病生物標志物的發現和檢測新技術的研發。針對呼出氣的分析，進行實驗室測量的大型儀器如GC-MS，配合固相微萃取和熱脫附等前處理方法，能夠全面的定性和定量分析呼出氣中的VOC，可以同時分析呼出氣中多種VOC的準確水平及在人群中的差異，快速確定與疾病相關的特異性VOC，但其操作難度高、專業性強、設備體積大、分析時間長、成本高等，不適用于現場實時的動態監測和低成本的快速疾病篩查，在臨床應用中的適用性有限。相比之下，基于氣體傳感器或傳感器陣列的設備具有可開發性、小巧易操作和成本低等巨大優勢，其在顯著降低醫療成本、人體健康監控和疾病診斷方面具有極大的潛力，未來可穿戴式的基于傳感器或傳感器陣列的設備將能夠實時監控人體的健康狀況。然而基于氣體傳感器或傳感器陣列的設備無法提供有關呼出氣成分的信息，通過目標氣體與傳感器的一系列反應來識別呼出氣中的目標化合物，很大程度上依賴于各種算法和廣泛的數據處理，因此需要結合大型儀器設備來實現混合VOC中多種成分的同時檢測。此外，已有研究證明嗅探犬能以“比偶然性好”的概率區分出肺癌和其他癌癥患者的典型呼吸氣味樣本與健康人的典型呼吸氣味樣本，未來利用嗅探犬通過氣味檢測實現快速、無痛且無創的疾病篩查與診斷具有極大的潛力。

隨著呼出氣檢測技術的不斷革新和科研人員對人體呼出氣奧秘的不斷探究，未來可發現人體呼出氣中各種與疾病相關的VOC生物標志物，建立其與疾病的確切關聯，呼出氣分析將用于可穿戴式的基于傳感器或傳感器陣列的設備實時監控人體的健康狀況以及成為醫療領域一種無創、快速、更加準確的疾病診斷方法，同時實現利用嗅探犬在人群中進行實際的疾病篩查。