耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌頭孢他啶/阿維巴坦的敏感性分析及療效評(píng)價(jià)

陸燕飛，鄭秀華，張曉慧，金菲，倪芳，梅亞寧，許雨喬(. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，南京009；. 臨沂市婦幼保健院檢驗(yàn)科，山東臨沂76000)

耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)的檢出率逐年增高[1]，給臨床抗感染治療帶來新的難題與挑戰(zhàn)。產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥主要機(jī)制[2]。碳青霉烯酶包括A、B、D類酶，其中A類和D類為絲氨酸碳青霉烯酶，B類為金屬碳青霉烯酶[3]。CRE碳青霉烯酶分型檢測(cè)對(duì)選擇恰當(dāng)?shù)闹委煼桨钢陵P(guān)重要[4]。頭孢他啶/阿維巴坦(ceftazidime-avibatan，CAZ/AVI)由頭孢他啶和新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦組合而成，2019年被國(guó)家藥品監(jiān)督管理局推薦用于治療CRE引起的復(fù)雜性腹腔感染和醫(yī)院獲得性肺炎等[5]，但其臨床療效研究尚不完善。本研究分析南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離170株CRE菌株碳青霉烯酶酶型以及對(duì)CAZ/AVI的敏感性，并回顧性分析CAZ/AVI的臨床療效，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2019年9月—2020年5月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床連續(xù)分離非重復(fù)CRE菌株170株。菌株鑒定采用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀并用Vitek MS復(fù)核，藥敏試驗(yàn)采用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀，亞胺培南或美羅培南最低抑菌濃度(MIC)≥4 μg/mL判為CRE菌株。回顧性分析170例CRE感染患者臨床資料，37例使用CAZ/AVI治療的患者作為試驗(yàn)組，患者均聯(lián)合其他抗菌藥物(合并碳青霉烯類抗菌藥物15例，頭孢哌酮/舒巴坦10例，替加環(huán)素6例，阿米卡星3例，多黏菌素2例和左氧氟沙星1例)；18例為下呼吸道感染，12例血流感染，6例腹腔感染和1例顱內(nèi)感染；病原菌分別為肺炎克雷伯菌(36株)和大腸埃希菌(1株)；均為產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶CRE，對(duì)CAZ/AVI均敏感。以性別、年齡、基礎(chǔ)疾病(惡性腫瘤、嚴(yán)重外傷、近期手術(shù)、嚴(yán)重感染性疾病、心功能不全)、入住ICU、侵襲性操作、氣管切開、感染部位和CRE酶型評(píng)估患者的傾向性評(píng)分值，通過鄰近匹配法從未使用CAZ/AVI治療患者中成功匹配到37例患者作為對(duì)照組，兩組在基礎(chǔ)疾病、臨床特征等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組中34例單藥治療(碳青霉烯類抗菌藥物15例，替加環(huán)素6例，頭孢哌酮/舒巴坦13例)，3例聯(lián)合治療(替加環(huán)素聯(lián)合比阿培南1例，替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦1例，比阿培南聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦1例)，病原菌分別為肺炎克雷伯菌(36株)和大腸埃希菌(1株)，且均為產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶CRE，對(duì)CAZ/AVI敏感。呼吸道感染、血流感染、腹腔感染和顱內(nèi)感染均以我國(guó)衛(wèi)生部制定的《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]為診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要儀器、試劑及菌株來源 Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀(法國(guó)生物梅里埃公司)；亞胺培南、美羅培南、CAZ/AVI藥敏紙片、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher公司)；頭孢他啶和阿維巴坦粉劑(美國(guó)輝瑞公司)；哥倫比亞血平板、巧克力平板、麥康凱平板和 M-H 瓊脂平板(鄭州安圖生物公司)；EDTA(中國(guó)碧云天公司)；H-1微型混合器(中國(guó)康禾公司)。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706和肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146，購(gòu)自上海漢尼生物細(xì)胞技術(shù)公司。

1.3藥物敏感性試驗(yàn) 用K-B紙片擴(kuò)散法復(fù)核藥敏結(jié)果，重復(fù)試驗(yàn)3次。K-B紙片擴(kuò)散法結(jié)果判讀根據(jù)CLSI M100-S30[7]，CAZ/AVI抑菌圈直徑≥21 mm為敏感，抑菌圈直徑≤20 mm為耐藥。抑菌圈直徑為20～22 mm的菌株再用肉湯稀釋法復(fù)核。CAZ/AVI肉湯稀釋法：將頭孢他啶藥物濃度倍比稀釋(0.5～512 μg/mL)，以每孔50 μL加入96孔板中，使其終濃度為0.125～128 μg/mL；將阿維巴坦藥物濃度稀釋至16 μg/mL，以每孔50 μL加入96孔板中，使其終濃度為4 μg/mL。制備菌株為0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙海?∶100稀釋后按每孔100 μL加入至96孔板，35 ℃溫育18～24 h，讀取結(jié)果。CAZ/AVI MIC≤8/4 μg/mL為敏感，≥16/4 μg/mL為耐藥。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.4碳青霉烯酶酶型檢測(cè) 根據(jù)CLSI M100-S30，采用mCIM聯(lián)合eCIM試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶。mCIM試驗(yàn)：取1 μL滿環(huán)菌落接種至2 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，震蕩混勻后放入1張10 μg美羅培南紙片并浸沒于菌懸液中，35 ℃溫育4 h。制備0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝淮竽c埃希菌ATCC 25922懸液涂布M-H平板；將美羅培南紙片從肉湯中取出并貼于M-H平板上，35 ℃溫育18～24 h后量取抑菌圈直徑。eCIM試驗(yàn)：mCIM試驗(yàn)同時(shí)取第2支含2 mL胰蛋白胨大豆肉湯的試管，加入20 μL 0.5 μmol/L乙二胺四乙酸溶液，剩余步驟同mCIM試驗(yàn)。mCIM和eCIM試驗(yàn)同步進(jìn)行。結(jié)果解釋：mCIM陽性，細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶；mCIM陰性，細(xì)菌不產(chǎn)碳青霉烯酶。mCIM陽性且eCIM陽性，細(xì)菌產(chǎn)金屬碳青霉烯酶；mCIM陽性且eCIM陰性，細(xì)菌產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶[8]。肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706分別作為mCIM試驗(yàn)的陽性和陰性對(duì)照，肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-2146作為eCIM試驗(yàn)的陽性對(duì)照。

1.5療效評(píng)價(jià)試驗(yàn) 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)治愈：感染癥狀、病原學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查均恢復(fù)正常；(2)有效：治療后患者感染癥狀基本消失或明顯減輕；(3)無效：治療后患者感染癥狀無改善、病情惡化或死亡[9]。比較兩組臨床有效(包括治愈、有效)和無效的病例數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPad軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(百分比)表示，采用Pearsonχ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1mCIM聯(lián)合eCIM試驗(yàn)結(jié)果 170株CRE菌株中，mCIM陽性165株，eCIM陽性35株；產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶130株，產(chǎn)金屬碳青霉烯酶35株，不產(chǎn)碳青霉烯酶菌株5株。146株肺炎克雷伯菌中mCIM陽性143株，eCIM陽性18株。12株大腸埃希菌中mCIM陽性10株，eCIM陽性2株。見表1。

表1 CRE菌株mCIM聯(lián)合eCIM結(jié)果(株)

2.2CAZ/AVI藥敏結(jié)果 K-B法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CRE對(duì)CAZ/AVI的敏感率為78.8%(134/170)，產(chǎn)絲氨酸酶CRE菌株對(duì)CAZ/AVI的敏感率為99.2%(129/130)，產(chǎn)金屬酶CRE敏感率為0(0/35)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=158.218，P<0.001)。52株CAZ/AVI抑菌圈直徑在20～22 mm范圍內(nèi)的CRE用肉湯稀釋法復(fù)核的MIC分布：CAZ/AVI=22 mm組MIC范圍為1/4～8/4 μg/mL，CAZ/AVI=21 mm組MIC范圍為1/4～16/4 μg/mL。獲得1株假性敏感CRE，產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶，CAZ/AVI抑菌圈直徑為21 mm，MIC為16/4 μg/mL(耐藥)。

2.3CAZ/AVI療效評(píng)價(jià) 試驗(yàn)組、對(duì)照組患者治療有效率分別為70.3%和45.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.497，P<0.05)，但兩組治療30 d患者病死率分別為32.4%和27.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)組中下呼吸道感染患者和血流感染患者CAZ/AVI治療有效例數(shù)高于對(duì)照組(P均<0.05)，見表2。6例腹腔感染和1例顱內(nèi)感染使用CAZ/AVI治療后，4例腹腔感染和1例顱內(nèi)感染患者臨床癥狀得到有效緩解。

表2 下呼吸道感染患者和血流感染患者的CAZ/AVI臨床療效比較

3 討論

本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制，86.21%肺炎克雷伯菌通過產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣克雷伯菌等主要產(chǎn)金屬碳青霉烯酶，弗氏檸檬酸桿菌和斯氏普羅威登菌各分離1株，均為產(chǎn)金屬碳青霉烯酶CRE，結(jié)果與Zhang等[10]對(duì)全國(guó)CRE耐藥基因分析數(shù)據(jù)一致。目前臨床使用的新型抗菌藥物CAZ/AVI對(duì)大多數(shù)絲氨酸碳青霉烯酶CRE有活性，但對(duì)金屬碳青霉烯酶CRE沒有活性[11]，因此CRE的碳青霉烯酶分型對(duì)于臨床精準(zhǔn)診療至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，CRE對(duì)CAZ/AVI的敏感率為78.8%，對(duì)產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶CRE敏感率為99.2%(129/130)。復(fù)核52株抑菌圈直徑在20～22 mm的CRE，獲得1株產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶CRE、CAZ/AVI抑菌圈直徑為21 mm(敏感)而MIC耐藥的假性敏感菌株，假敏感率為1.90%。目前國(guó)內(nèi)尚未有相關(guān)數(shù)據(jù)報(bào)道。K-B法方法學(xué)的局限性以及CAZ/AVI紙片中頭孢他啶和阿維巴坦的含量與臨床使用劑量不同，可能使抑菌圈直徑在20～22 mm內(nèi)的菌株存在一定的假性敏感或耐藥。

試驗(yàn)組經(jīng)CAZ/AVI治療后總有效例數(shù)高于對(duì)照組，但兩組30 d死亡率無差異，CAZ/AVI能夠有效治療CRE引起的感染，但因兩組患者病情嚴(yán)重，且多存在侵襲性操作，控制感染并不能顯著降低患者死亡率。下呼吸道感染患者治療有效例數(shù)高于對(duì)照組(P<0.005)，6例腹腔感染患者使用CAZ/AVI治療后有4例患者感染癥狀緩解，證實(shí)CAZ/AVI用于治療腹腔感染和肺炎效果較好。對(duì)于CRE引起的血流感染，試驗(yàn)組有效例數(shù)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚需更大樣本、高質(zhì)量的臨床研究來驗(yàn)證此結(jié)果。對(duì)于產(chǎn)金屬碳青霉烯酶CRE引起的感染，阿維巴坦聯(lián)合氨曲南具有良好的抗菌作用[12]。綜上所述，產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶的CRE對(duì)CAZ/AVI有很高的敏感性，CAZ/AVI可顯著提高治療上述CRE感染的有效率。