無精子癥患者Y染色體序列標簽位點-聚合酶鏈反應與二代測序檢測的比較*

張帆，劉永杰，代良(銀川市婦幼保健院生殖醫學中心，銀川 750001)

人群中約有15%的夫婦受不孕不育影響，男女因素各占一半[1]，男方因素除了少弱畸形精子癥外，無精子癥甚至占到10%。導致無精子癥發生的因素有很多，遺傳因素所致的非梗阻性無精子癥尤為復雜，Y染色體微缺失是僅次于克氏征(klinefelter syndrome)導致睪丸生精障礙的第二大遺傳因素[2]，患病率為2%～10%[3]。采用序列標簽位點-聚合酶鏈反應(STS-PCR)檢測Y染色體無精子因子(azoospermia factor，AZF)的微缺失是臨床上男科醫生判斷無精子癥病因以及決策后續治療手段的重要實驗室依據[4]，檢測方法較為成熟，結果可靠。目前采用高通量DNA測序技術——二代測序(next generation sequencing，NGS)檢測100 kb以上基因組拷貝數變異(copy number variation，CNVs)的出現為無精子癥遺傳因素的探討打開了新的思路，但檢測結果的準確性有待商榷。為此，我們收集了133例無精子癥患者，針對Y染色體分別用STS-PCR檢測AZF、NGS檢測CNVs，并分析比較2種檢測方法的結果。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2018年10月至2020年10月就診于銀川市婦幼保健院生殖醫學中心的非梗阻性無精子癥患者133例，年齡23～45歲。排除梗阻性無精子癥、隱睪、精索靜脈曲張、睪丸損傷等因素所致的無精子癥。所有參與本研究的患者均簽署知情同意書，且本研究獲得我院醫學倫理委員會批準(批準文號：2021012)。

1.2主要儀器與試劑 基因擴增儀(美國Thermo Fisher公司)，YN sep100全自動單通道毛細管電泳儀(亞能生物技術有限公司)，NextSeq CN500基因測序儀(美國Illumina公司)。核酸提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，Y染色體微缺失基因檢測試劑盒(亞能生物技術公司)，染色體拷貝數變異檢測試劑盒(杭州貝瑞和康基因診斷技術公司)。

1.3STS-PCR檢測Y染色體AZF微缺失 《歐洲Y染色體微缺失分子診斷指南》[5]推薦的檢測AZF微缺失包括6個STS，本研究經改良STS-PCR檢測體系，擴增為15個STS，包括AZFa區的sY84/sY86、AZFb區的sY124/sY127/sY128/sY133/sY134/sY143/sY1192、AZFc區的sY152/sY239/sY242/sY254/sY255以及AZFb/c區的sY145。根據各STS基因序列特點，設計高度特異的引物，檢測人類男性Y染色體性別決定基因(sex-determining region of Y-chromosome，SRY)作為性別異常對照以及人類鋅指蛋白基因ZFX/Y作為實驗內控。對研究對象的外周抗凝全血標本依次進行DNA提取、PCR擴增、毛細管電泳檢測等步驟，最終分析判讀電泳結果。由寧夏金域醫學檢驗所(有限公司)完成檢測。

1.4NGS檢測Y染色體CNVs 從研究對象的外周抗凝全血標本中提取基因組DNA，取10 ng DNA采用“快速PCR-free文庫構建技術”構建文庫，打斷DNA，修復酶切缺口和雙鏈末端，磷酸化修飾并與引物連接后，用NextSeq CN500基因測序儀測序，用杭州貝瑞和康基因診斷技術公司的數據分析軟件分析數據，仔細篩選出Y染色體的CNVs檢測結果，該結果是綜合參考人類基因組hg19版本、基因組變異數據庫(DGV)、人類染色體不平衡和表型數據庫(DECIPHER)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)、加利福尼亞大學圣克魯茲分校數據庫(UCSC)及PubMed等公共數據庫的最新公布數據而確定的。由北京貝瑞和康生物技術公司完成。

1.5統計學分析 所有資料均錄入EXCEL表，計數資料采用率(%)表示。采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。用卡方檢驗分析2種檢測方法的差異性，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1STS-PCR檢測Y染色體AZF微缺失情況 檢測15個STS位點時，133例無精子癥患者中，Y染色體AZF微缺失異常17例(12.78%)，其中缺失14個STS 1例，占5.88%；缺失12個STS 3例，占17.65%；缺失11個STS 1例，占5.88%；缺失6個STS 1例，占5.88%；缺失5個STS 1例，占5.88%；缺失4個STS 2例，占11.76%；缺失2個STS 1例，占5.88%；缺失1個STS 7例，占41.18%。檢測經典的6個STS(sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255)時[5]，133例無精子癥患者中，Y染色體AZF微缺失異常10例(7.52%)，其中缺失6個STS 1例，占10%；缺失4個STS 4例，占40%；缺失2個STS 5例，占50%。見表1。

2.2NGS檢測Y染色體CNVs的情況 133例無精子癥患者中，Y染色體CNVs異常12例(9.02%)，其中既重復又缺失3例，占25%；重復(dup)4例，占33.33%；缺失(del)5例，占41.67%。見表1。

2.3Y染色體AZF微缺失與CNVs缺失的比較 133例無精子癥患者中，STS-PCR檢測Y染色體AZF的15個STS微缺失的結果與NGS檢測Y染色體CNVs缺失的結果比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2；STS-PCR檢測Y染色體AZF的6個STS微缺失的結果與NGS檢測Y染色體CNVs缺失的結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 Y染色體AZF(15個STS)微缺失與CNVs缺失的比較

表3 Y染色體AZF(6個STS)微缺失與CNVs缺失的比較

3 討論

WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版指出,精液連續3次離心后取沉淀,顯微鏡鏡檢未見精子即為無精子癥[6]。根據精子發生及精道的暢通與否，可分為梗阻性無精子癥(obstructive azoospermia，OA)與非梗阻性無精子癥(nonobstructive azoospermia，NOA)。OA可以通過手術解除梗阻或通過睪丸精子抽吸術(testicular sperm aspiration，TESA)來獲取精子，而NOA卻辦法甚少。導致NOA的因素多種多樣，其中遺傳因素是最為復雜的原因。Y染色體是人類僅有的單倍遺傳的染色體[7]，作為男性性別決定基因的載體，包含許多與精子發生相關的基因。然而Y染色體特有的多拷貝基因、重復序列以及高度多態性等特點[8]，更容易導致男性不育。

1976年Tiepolo等[9]首次提出Y染色體長臂(Yq11)上存在與精子發生相關的基因，即AZF，其內密集排列著大量與生精相關的基因。近年來許多研究發現Y染色體AZF微缺失引起的睪丸生精障礙是導致男性不育的重要遺傳因素，臨床上表現為男性無精子癥和嚴重少精子癥[10]，其中，無精子癥Y染色體AZF微缺失的發生率為10%～15%，嚴重少精子癥Y染色體AZF微缺失的發生率為5%～10%。Vogt等[11]將Y染色體AZF劃分為a、b、c 3個相互獨立的區域，其中以AZFc區的缺失最多見，約占60%，AZFb區的缺失次之，AZFa區缺失最少見。我們的實驗結果與其基本一致。AZFa區缺失的患者表現為唯支持細胞綜合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)，伴睪丸體積縮小，無精子生成。AZFb區缺失的患者會導致男性精子細胞成熟障礙，生精阻滯于減數分裂前期或減數分裂期，睪丸活檢可見精原細胞和初級精母細胞，無精子生成[12]。AZFc區缺失最常見[13]，組織學表型及臨床表現多樣，其中約2/3的患者表現為無精子癥。

值得一提的是，本研究中的133例無精子癥患者中，有9例AZFb區(sY1192)缺失，檢出率高達6.77%，且其中7例僅為sY1192單一缺失。但目前有關sY1192位點缺失的病例罕見報道，其引起生精阻滯的機制及意義有待進一步明確。在經典6個STS檢測的基礎之上是否需要增加該位點的檢測值得進一步探索。

NGS技術通過檢測100 kb以上基因組CNVs來分析Y染色體畸變情況。Zhu等[14]研究表明CNVs的大小與男性不育癥相關。本研究發現，NGS檢出的Y染色體CNVs重復(dup)是目前STS-PCR無法檢出的。因此，我們推測基因重復也有可能導致無精子癥。在檢測基因缺失方面，STS-PCR檢測Y染色體AZF微缺失與NGS檢測Y染色體CNVs缺失(del)的一致性比較，目前尚無相關報道。有文獻顯示AZFc區的CNVs與男性生精障礙的風險增加相關[15]，但是關于二者檢測基因缺失方面的意義尚不明確。本研究發現，Y染色體AZF(15個STS)微缺失的結果與CNVs缺失結果相比，差異有統計學意義(P<0.05)，而Y染色體AZF(經典6個STS)微缺失的結果與CNVs缺失結果相比，差異無統計學意義(P=0.357)。由于目前檢測的是100 kb以上的CNVs，可能存在某些STS位點漏檢的情況，尤其是新的STS如sY1192或小片段的缺失。如果未來技術允許檢測更小的CNVs片段，對于探索Y染色體基因層面導致男性不育癥將會有極大的價值。

綜上所述，采用STS-PCR檢測Y染色體AZF微缺失是無精子癥的重要實驗室遺傳檢測手段，但究竟檢測多少個STS位點更合適，仍需探索。采用NGS檢測Y染色體CNVs尚未被廣泛應用，但本研究發現其在診斷無精子癥的遺傳依據方面，有其獨特價值。因此，我們認為2種檢測方法互有補充，通常情況下，對于無精子癥患者，可以考慮采用NGS作為篩選，而采用STS-PCR作為驗證。關于2種檢測方法的價值與意義，有待進一步探討。