多重PCR聯合毛細管電泳技術檢測碳青霉烯酶基因*

孫寧，于娟，余柏增，陳勇，曹進，黃紅娟，王衛萍，張立平，李曉軍,3(. 東部戰區總醫院基礎醫學實驗室，南京 000；. 南京市溧水區人民醫院檢驗科，南京00；3. 南京大學生命分析化學國家重點實驗室，南京 000)

近年來，臨床分離革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率逐年升高[1-2]。菌株對碳青霉烯耐藥機制主要有3種，產碳青霉烯酶，藥物作用靶點的改變，膜通透性降低及外排作用[1-2]，其中產碳青霉烯酶是最主要機制。目前已有多種碳青霉烯酶被發現，其中KPC、NDM、OXA-48、VIM和IMP在世界范圍內廣泛分布[3]。臨床實驗室對細菌耐藥性檢測多以表型分析進行。近年來，以PCR為基礎的核酸擴增技術逐漸用于碳青霉烯酶基因的檢測，如實時熒光PCR和多重PCR。此外，一些商業化的試劑已被用于碳青霉烯酶基因檢測，如Xpert Carba-R[4-5]。為準確分析革蘭陰性桿菌碳青霉烯類耐藥機制，監控院內感染的傳播，本研究建立一種單管多重PCR聯合毛細管電泳(multiplex PCR combined with capillary electrophoresis, mPCR-CE)方法同時檢測blaNDM、blaVIM、blaKPC和blaOXA-484種碳青霉烯酶基因，并對該方法進行評價。

1 材料與方法

1.1菌株 采用東部戰區總醫院基礎醫學實驗室微生物室保存的產碳青霉烯酶臨床分離株[6]作為陽性對照菌株，包括：攜帶blaVIM惡臭假單胞菌(P.putida)，攜帶blaNDM-1肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)和攜帶blaKPC-2K.pneumonia(ATCC BAA-1705)，攜帶部分blaOXA-48基因序列的大腸埃希菌E.coli(DH5α)由人工合成，以及攜帶其他β-內酰胺酶(TEM-1、CTX-M-5和SHV-1)基因的大腸埃希菌，攜帶MIR-1基因的肺炎克雷伯菌，分別攜帶IMP-4和IMP-9基因的銅綠假單胞菌、弗勞地檸檬酸桿菌，以上類型菌株各1株。收集東部戰區總醫院2019年2—3月間采用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統GN-09卡檢測為碳青霉烯耐藥(腸桿菌科細菌亞胺培南和美羅培南MICs≥4 μg/mL，非發酵菌亞胺培南和美羅培南MICs≥8 μg/mL，腦膜敗血性黃桿菌亞胺培南和美羅培南的MICs≥4 μg/mL)菌株68株，分別為肺炎克雷伯菌22株，大腸埃希菌10株，銅綠假單胞菌16株，黏質沙雷菌7株，陰溝腸桿菌2株，雷極普羅威登斯菌1株，腦膜敗血性黃桿菌1株，弗氏檸檬酸桿菌1株，臭鼻克雷伯菌3株，摩根摩根菌2株，奇異變形桿菌3株，藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2主要試劑及儀器 TIANamp Bacteria DNA Kit(DP302，北京天根生化科技公司)；Premix Taq Hot Start Version和Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(大連寶生物公司)；Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(法國生物梅里埃公司)；MaxyGene II梯度PCR儀(美國Anxygen公司)；ABI 3730XL測序儀(美國賽默飛世爾公司)。本研究中所用引物的合成和擴增產物測序均由生工(上海)生物工程有限公司完成。

1.3DNA提取 采用加熱煮沸法提取細菌菌落DNA。挑取單菌落，將其溶于100 μL滅菌去離子水中，煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，轉移上清液至新的離心管中，取5 μL用于PCR或置于-20 ℃保存。采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取細菌溶液DNA，按試劑盒說明書進行操作。

1.4引物設計和合成 根據NCBI數據庫中已發表的碳青霉烯酶基因blaVIM(NG_050336)、blaNDM(NG_049326)、blaKPC(NG_049253)、blaOXA-48(NG_049762)序列，利用軟件ClustalW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)進行多重比對，并根據保守區，采用軟件Primer Premier 3(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設計特異性引物。為監控整個反應體系，設計革蘭陰性桿菌16S rRNA基因引物。在上游引物的5′端標記FAM基團用于毛細管電泳分析。引物由上海生工生物工程公司合成。見表1。

表1 用于多重PCR和單重PCR的引物

1.5mPCR-CE 采用25 μL體系：2×Multiplex PCR Buffer(Mg2+, dNTP plus)12.5 μL，NDM-F和NDM-R(10 μmol/L)各0.24 μL，VIM-F和VIM-R(10 μmol/L)各0.24 μL，KPC-F和KPC-R(10 μmol/L)各0.24 μL，OXA-48-F和OXA-48-R(10 μmol/L)各0.16 μL，16S-F和16S-R(10 μmol/L)各0.1 μL，Multiplex PCR Enzyme Mix 0.5 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 5.54 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(從65 ℃開始，每個循環退火溫度降低0.5 ℃)，72 ℃ 30 s，10個循環；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。取1 μL擴增產物，9 μL高度去離子甲酰胺(HiDi)與分子內標Liz500(體積比為250∶1)的混合物，加入96孔板中，95 ℃變性5 min，立即置于冰上，采用ABI 3730XL進行檢測。檢測結果的判定標準：若熒光強度低于分子內標的熒光強度，則判定為陰性；若片段長度在正確位置，并且熒光強度大于分子內標的熒光強度則判定為陽性，且16S rRNA基因檢測結果為陽性。

1.6特異性和靈敏度分析 將0.5麥氏濁度單位(1.5×108CFU/mL)攜帶blaKPC、blaNDM、blaOXA-48和blaVIM的細菌進行10倍梯度稀釋，利用試劑盒提取各稀釋液細菌DNA，并進行mPCR-CE檢測。將攜帶除上述基因外的其他β-內酰胺酶基因的菌株濃度調整至0.5麥氏濁度單位，用細菌DNA提取試劑盒提取DNA，行mPCR-CE檢測，用于特異性評價。

1.7mPCR-CE檢測臨床菌株中碳青霉烯酶基因 將68株細菌接種M-H平板，過夜培養后，挑取單菌落溶于100 μL滅菌去離子水中，用加熱煮沸法提取細菌DNA，取5 μL作為模板用于mPCR-CE檢測。

1.8普通PCR與測序 取5 μL采用煮沸法提取的細菌DNA，利用blaKPC、blaNDM、blaVIM和blaOXA-48引物進行單重PCR后測序驗證。PCR反應體系為25 μL，包括：2×Premix Taq Hot Start Version 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL， DNA模板5 μL，ddH2O 6.5 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。取10 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并將剩余陽性擴增產物送上海生工生物公司，在ABI 3730xl測序儀上進行一代測序分析，測序結果提交NCBI數據庫，進行BLAST比對分析。

2 結果

2.1特異性 mPCR-CE檢測攜帶blaNDM、blaVIM、blaKPC、blaOXA-48菌株分別在116 bp、130 bp、150 bp、186 bp片段大小處檢出特異峰，16S rRNA基因片段大小為229 bp，結果與預期相符，而對其他耐藥基因無交叉反應。見圖1。

注：A，攜帶blaNDM-1的肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)； B，攜帶blaVIM的惡臭假單胞菌(P. putida)； C，攜帶blaKPC-2的K. pneumonia(ATCC BAA-1705)；D，攜帶部分blaOXA-48基因序列的E. Coli(DH5α)；E，分別攜帶TEM-1、CTX-M-5、AmpC、SHV-1、MIR-1、IMP-4、IMP-9的臨床分離菌株。

2.2靈敏度 mPCR-CE檢測blaNDM、blaVIM和blaKPC的檢測限為1.5×102CFU/mL，blaOXA-48的檢測限為1.5×103CFU/mL。見圖2。

注：A—E濃度依次為1.5×105 CFU/mL、1.5×104 CFU/mL、1.5×103 CFU/mL、1.5×102 CFU/mL、1.5×101 CFU/mL。

2.3臨床分離菌株PCR-CE檢測結果 經PCR結合測序分析，68株菌株中檢出45株攜帶碳青霉烯酶基因，包括攜帶blaKPC37株和攜帶blaNDM8株；未檢出攜帶blaVIM和blaOXA-48菌株。22株肺炎克雷伯菌中檢出攜帶blaKPC基因16株，攜帶blaNDM基因1株；10株大腸埃希菌中檢出攜帶blaKPC6株，攜帶blaNDM2株。16株銅綠假單胞菌檢出攜帶blaKPC基因5株，未檢出攜帶其他3種碳青霉烯酶基因。黏質沙雷菌、奇異變形桿菌和摩根摩根菌中均發現了攜帶blaKPC和blaNDM的耐藥菌株，同時2株奇異變形桿菌同時攜帶了blaKPC和blaNDM2種耐藥基因。mPCR-CE檢測68株碳青霉烯耐藥菌株碳青霉烯酶攜帶情況與PCR擴增結合測序結果一致性為100%。見表2和圖3。

表2 mPCR-CE與單重PCR測序檢測碳青霉烯酶基因情況

圖3 攜帶blaKPC(A和C)和blaNDM(B和D)的肺炎克雷伯菌的單重PCR Sanger測序與參考序列比對結果

3 討論

在臨床微生物學實驗室中，細菌耐藥性多采用表型分析的方法，如稀釋法、藥敏紙片法等，而對于細菌是否產碳青霉烯酶，還需表型確認實驗，如Hodge試驗、mCIM試驗等。這些方法普遍存在檢測時間過長、操作復雜等缺點[7]。碳青霉烯類耐藥基因分子診斷技術主要是采用多重PCR或實時熒光PCR方法進行檢測，這兩種方法各有各的優缺點，比如多重PCR可檢測超過4種以上的碳青霉烯酶基因或多種β-內酰胺酶基因，但是擴增產物需采用瓊脂糖凝膠電泳的方式進行分析，敏感性低，重復性差[6,8]；而實時熒光PCR具有靈敏度高、特異性強等優點，但是受到檢測通道的限制，靶標基因檢測數量有限[9]。因此，在一些實時熒光PCR方法中將碳青霉烯酶基因分組，而后通過多管多重PCR反應檢測[10]；同時，也有一些方法通過設計特殊的裝置達到擴增反應的物理分離，如賽沛Xpert Carba-R[4-5]以及微流控芯片方法[11]，從而達到多靶標基因的檢測。

本研究利用毛細管電泳技術代替瓊脂糖凝膠電泳，以攜帶4種碳青霉烯酶基因的耐藥菌作為參考菌株，分析該方法的靈敏度。研究發現，多重PCR毛細管電泳的最低檢測限處于1.5×102～1.5×103CFU/mL之間，雖然明顯高于單重實時熒光PCR的最低檢測限，但與多重實時熒光PCR的最低檢測限相差不大[12-13]。用該方法檢測攜帶其他β-內酰胺酶基因的細菌，結果顯示無明顯的交叉反應。同時，我們在mPCR-CE中加入了16S rRNA基因用于監控整個反應體系，大大提高了檢測過程的準確性。多重PCR毛細管電泳技術具有以下3點不足：(1)耗時長，因多重PCR的擴增產物需先進行變性，而后通過毛細管電泳進行分析，從而導致該方法不適合于快速檢測，尤其是臨床標本的快速檢測；(2)相比于瓊脂糖凝膠電泳方法，成本較高；(3)檢測的靶標基因數量有限，如缺少blaIMP，相對于毛細管電泳技術的高分辨率，可通過進一步優化多重PCR反應，增加靶標基因的數量。對臨床分離68株碳青霉烯耐藥菌株檢測，并與常規PCR測序結果進行比較，結果顯示，2種方法的檢測結果完全一致。結果表明，該方法可有效用于4種碳青霉烯酶基因的檢測。在耐藥菌株碳青霉烯酶基因的檢測中，并未發現攜帶blaVIM和blaOXA-48的菌株，這主要是由于這兩種基因分別流行于地中海國家和歐美國家，在我國較少出現[14]。

綜上所述，本研究建立了一種可用于同時檢測4種常見的碳青霉烯酶基因的多重PCR毛細管電泳方法，并且設置16S rRNA基因為內參基因，用于監控整個檢測過程，該方法可有效用于調查臨床分離菌株的碳青霉烯酶基因的攜帶情況。