不同新型冠狀病毒核酸檢測試劑的臨床性能評價

耿幟，徐遠東，包一熙，陳鳳花(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院檢驗科，武漢 430022)

應用實時熒光PCR檢測呼吸道標本中新型冠狀病毒(2019-nCoV)RNA，是診斷新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者以及篩查無癥狀感染者的主要手段之一，但2019-nCoV核酸檢測可能受到患者病程、標本采集、核酸提取設備及相應試劑、核酸擴增試劑及實時熒光PCR儀等多種因素的影響[1]。目前有多種2019-nCoV RNA檢測的RT-PCR試劑盒已獲得中國國家藥品監督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)、美國食品藥品監督管理局 (Food and Drug Administration，FDA)緊急使用授權(EUA)、世界衛生組織(World Health Organization, WHO)應急使用清單(Emergency Use Listing，EUL)和體外診斷歐盟認證(CE-IVD)批準，不同生產廠家聲稱的試劑分析靈敏度不同。對于醫療機構的臨床實驗室，為避免產生假陰性結果，選擇靈敏度高、臨床檢測性能佳的2019-nCoV RNA檢測試劑至關重要[2]。另外，標本周轉時間(turnaround time, TAT)也是影響試劑選擇的重要因素。在2019-nCoV核酸檢測設備包括核酸提取儀和實時熒光PCR儀等資源有限的情況下，縮短PCR擴增時間，有助于縮短TAT，提高實驗室2019-nCoV核酸檢測能力。本實驗室經性能驗證后選擇達安公司試劑檢測臨床樣本2019-nCoV核酸，近期該廠家又推出一款擴增時間短的試劑，聲稱新試劑分析靈敏度不變，但擴增時間由110 min減少至62 min。為確定是否能將擴增時間長的試劑更換為擴增時間短的試劑，本研究對同一廠家生產的這兩種不同2019-nCoV RNA檢測試劑進行臨床性能評價。

1 資料與方法

1.1臨床樣本 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院2020年2月9日發熱門診患者130例，其中，男性56例，女性74例；年齡10～90歲，中位年齡48.5歲。

1.2儀器與試劑 GeneRotex 96全自動核酸提取儀(蘇州天隆公司)，ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)；Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒(磁珠法，蘇械備20151030，蘇州天隆公司)，2019-nCoV RNA液體室內質控品S2[以開放讀碼框1ab(open reading frame 1ab,ORF1ab)濃度賦值17 300 copies/mL，溯源到國家二級標準物質GBW(E)091132/GBW(E)091133，廣州邦德盛公司]，試劑A: 新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，國械注準20203400063)、試劑B: 新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，國械注準20203400749)(中山大學達安公司)。

1.3分析靈敏度評價 用2019-nCoV陰性混合樣本，梯度稀釋定值質控品S2(17 300 copies/mL)至1 730、865、567.7、432.5、216.3和108.2 copies/mL 6個濃度；按照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)EP17-A2，每個濃度每天做7～8個復孔，連續3 d，共計23孔，進行核酸提取和實時熒光RT-PCR擴增以評估分析靈敏度。廠家聲稱試劑A和B分析靈敏度均為500 copies/mL。

1.4核酸提取 取200 μL咽拭子病毒保存液或不同濃度質控品稀釋液，用Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒在GeneRotex 96全自動核酸提取儀上提取核酸，按照試劑說明書進行操作，將提取的核酸保存于-80 ℃備用。

1.52019-nCoV RNA擴增檢測 試劑A和B檢測的靶基因均為2019-nCoV ORF1ab基因和核殼蛋白(nucleocapsid, N)基因；檢測的熒光均為FAM、VIC和Cy5三通道；均檢測內源性內標，以監測咽拭子樣本采集、核酸提取和PCR擴增過程的有效性。試劑A和B的PCR反應體系總體積均為25 μL，包括17 μL PCR反應液A，3 μL PCR反應液B，5 μL核酸模板，均在ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進行擴增。試劑A和B的擴增條件不同，對應的擴增時間分別為110 min和62 min。試劑A的擴增條件為：50 ℃ 15 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s檢測熒光，45個循環。試劑B的擴增條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，10個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s檢測熒光，32個循環。每批次設3個陰性質控和1個弱陽性質控。試劑A和B的陽性結果判斷的循環閾值(cycle threshold, Ct)分別為Ct≤40和Ct≤30。

1.6相對靈敏度評價 選取試劑A檢測ORF1ab和N基因的Ct值為18～27的5例2019-nCoV強陽性核酸，用天隆公司的洗脫液進行連續10倍梯度稀釋[3]，然后同時用試劑A和B進行檢測，原倍核酸做2個復孔，每個稀釋度做3個復孔，分析不同稀釋度靶基因的檢出率和Ct變化。

1.7臨床檢測性能比較 試劑A和B同時檢測130例咽拭子樣本核酸，分析其陽性符合率、陰性符合率等，第一次檢測結果為靶基因單陽的臨床樣本核酸進行雙孔復查，根據試劑說明書判定結果。

1.8統計學分析 用SPSS 20.0統計軟件進行。計數資料以例數和百分率表示，率的比較采用Fisher精確概率法，一致性分析采用Kappa檢驗，最低檢測限采用Probit分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1分析靈敏度評價 質控品S2的賦值以ORF1ab為準。試劑A和B均能100%(23/23)檢測到濃度為1 730 copies/mL的S2稀釋液中ORF1ab基因，隨著稀釋液濃度降低，ORF1ab的檢出率逐漸降低。試劑A和B檢測865、567.7、432.5、216.3和108.2 copies/mL的S2稀釋液中ORF1ab基因的陽性率分別為95.65%(22/23)和82.61%(19/23)、95.65%(22/23)和78.26%(18/23)、91.30%(21/23)和78.26%(18/23)、65.22%(15/23)和43.48%(10/23)、34.78%(8/23)和17.39%(4/23)。根據Probit分析，算得試劑A和B的最低檢測限分別為615.9(95%CI：446.0～1 098.5)copies/mL和1 249.1(95%CI：863.4～2 378.8)copies/mL。

2.2相對分析靈敏度評價 用洗脫液連續10倍梯度稀釋5例2019-nCoV強陽性的臨床樣本核酸進行相對分析靈敏度評價。結果顯示，在1∶10和1∶100稀釋時，試劑A和B均能100%檢測到ORF1ab和N基因；而1∶1 000稀釋時，試劑A對ORF1ab和N基因的檢出率均為100%，試劑B的檢出率分別為73.33%和80.00%，見表1。在原倍、1∶10和1∶100稀釋時，試劑A檢測ORF1ab和N基因的Ct分別為24.66±2.34和22.70±2.32、28.38±2.19和26.25±2.22、32.16±2.23和30.07±2.29，試劑B檢測ORF1ab和N基因的Ct分別為16.35±2.46和14.50±2.35、19.15±2.28和17.93±2.42、22.47±2.35和21.97±2.56；連續10倍稀釋，試劑A和B檢測ORF1ab和N基因的平均Ct增加2.80～4.04。

表1 2種試劑檢測5例2019-nCoV強陽性標本不同稀釋度核酸的相對分析靈敏度[n(%)]

2.32種試劑的臨床檢測性能評價 2種試劑檢測130例咽拭子樣本核酸中2019-nCoV的 ORF1ab和N基因，試劑A第一次檢測出45例雙陽、4例ORF1ab單陽、8例N單陽和73例陰性，試劑B第一次檢測出34例雙陽、4例ORF1ab單陽、6例N單陽和86例陰性，每種試劑第一次檢測的單陽繼續用相應試劑雙孔復查，最終試劑A檢測出57例(43.85%)2019-nCoV RNA陽性、73例(56.15%)2019-nCoV RNA陰性，而試劑B則檢測出43例(33.08%)陽性、87例(66.92%)陰性。經Fisher精確概率法檢驗，這2種試劑檢測的陽性率差異有統計學意義(P<0.05)。而有1例樣本，試劑A檢測陰性、試劑B檢出N單陽，隨后雙孔復查為陰性，根據試劑說明書判定為陰性。應用Kappa一致性檢驗分析發現：2種試劑的檢測結果一致性較好(kappa=0.775 3)，陽性率符合率為75.44%(43/57)，陰性符合率為100%(73/73)，陽性預測值為100%(43/43)，陰性預測值為83.91%(73/87)，總符合率為89.23%(116/130)。

3 討論

本研究進行2種試劑的臨床檢測性能評價，以確定能否將試劑A更換為試劑B，縮短TAT、提高核酸檢測能力。雖然廠家聲稱的試劑A和B的分析靈敏度均為500 copies/mL，但是梯度稀釋定值質控品進行分析靈敏度驗證，發現試劑A和B的分析靈敏度分別為615.9和1 249.1 copies/mL；進一步應用2019-nCoV陰性混合樣本梯度稀釋5例強陽性臨床樣本核酸進行檢測，發現試劑A和B 100%檢出ORF1ab和N基因的最高稀釋度分別為1∶1 000和1∶100，這些均提示試劑A的實際分析靈敏度比試劑B高。有研究應用數字PCR發現試劑A的分析靈敏度為484 copies/mL[4]，每反應體系靈敏度為1～10 copies[5]，與本研究發現的試劑A分析靈敏度615.9 copies/mL稍有差異，可能是由于定值的溯源性不同以及梯度稀釋的基質不同等因素所致。

對于130例咽拭子樣本核酸，試劑A檢出的陽性率43.85%顯著高于試劑B的陽性率33.08%，其中有14例樣本試劑A檢出陽性而試劑B漏檢，進一步分析發現這14例樣本應用試劑A檢測到ORF1ab或N基因的Ct大多為36～40，可能是由于試劑B的實際分析靈敏度低于試劑A所致。應用Kappa一致性檢驗發現：試劑A和B的檢測結果一致性較好(kappa=0.775 3)，陽性符合率為75.44%，陰性符合率為100%，陽性預測值為100%，陰性預測值為83.91%，總符合率為89.23%，提示試劑A和B的臨床檢測性能存在差異。

總之，本研究發現2種2019-nCoV核酸檢測試劑的臨床性能之間存在差異。為保證2019-nCoV核酸的檢測質量，不宜將擴增時間長的試劑更換為擴增時間短的試劑。