食物成分對腸道細胞DNA雙鏈斷裂損傷的保護作用及機制研究進展

彭 珍，許曉燕，熊 濤

（南昌大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

DNA雙鏈斷裂是最嚴重的DNA損傷，可引起細胞周期阻滯和細胞增殖障礙，導致基因組不穩定從而誘發免疫缺陷、早衰、腫瘤和神經退行性病變等疾病[1-3]。許多因素如電離輻射、擬輻射化學物質、基因毒性劑和致病菌等均可引起細胞DNA雙鏈斷裂[4]。腸道微生物是引起人體腸道細胞DNA雙鏈斷裂的主要外源因素，包括致病菌和共生菌在內的微生物可通過毒力因子或黏附素誘導宿主核酸DNA雙鏈斷裂和誘發腸癌[5-7]。因此，在日常膳食中攝入有效緩解腸細胞DNA雙鏈斷裂的食物是防止腸癌形成的措施之一。本文綜述了對腸道細胞DNA雙鏈斷裂有保護作用的常見食物成分及其作用機制，并以此為依據提出了益生菌保護腸道細胞DNA雙鏈斷裂的可能性，為后續開發有效緩解DNA雙鏈斷裂和預防相關疾病的功能性保健食品提供參考。

1 腸道細胞DNA雙鏈斷裂及其應答機制

1.1 腸道細胞DNA雙鏈斷裂

完整的基因組是細胞發揮功能和維持生存的必要條件，多種致病菌或人體共生菌可誘導宿主胃腸道細胞發生DNA氧化損傷，造成DNA雙鏈斷裂。2006年，Nougayrède等報道了大腸桿菌誘導HeLa、CHO、A375、IEC-6等細胞形成DNA雙鏈斷裂[8]。大腸桿菌IHE3034與HeLa細胞共孵育4 h即造成HeLa細胞體和細胞核漸行性增大，同時有絲分裂消失。采用免疫組化技術檢測到DNA雙鏈斷裂標志物——組蛋白H2AX磷酸化（histone H2AX phosphorylation，γH2AX），該損傷導致細胞周期阻滯于G2/M期。細胞周期阻滯通常由細胞致死膨脹毒素、周期抑制因子、細胞毒性壞死因子或α-溶血素誘導形成，而敲除了上述毒力基因的大腸桿菌IHE3034同樣能造成細胞周期阻滯，說明引起DNA雙鏈斷裂的大腸桿菌細胞毒素并不是以上毒素。隨后，通過構建大腸桿菌轉座子突變體發現，編碼肽聚酮的pks毒力島是造成HeLa細胞DNA雙鏈斷裂的關鍵。人體糞便中分離到的大腸桿菌中，約有34%含有pks毒力島，該毒力島普遍存在于B2型大腸桿菌中。為了探索DNA雙鏈斷裂對機體造成的后果，構建了大腸桿菌誘導的DNA雙鏈斷裂小鼠模型，并通過該模型證實了大腸桿菌誘導的DNA雙鏈斷裂與腸癌密切相關[9]。近年來，有報道指出普遍存在于大腸桿菌的外膜囊泡誘導HeLa細胞產生了γH2AX，說明部分人體共生菌也可引起DNA雙鏈斷裂和造成基因組不穩定[10]。

幽門螺桿菌慢性感染人胃黏膜是形成胃癌的主要原因。Toller等提出幽門螺桿菌誘導形成胃癌的機制可能是該菌與胃的長期共存過程中造成了胃細胞DNA雙鏈斷裂積累，隨后通過體內外實驗證實了幽門螺桿菌依賴黏附素BabA而非Cag毒力島引起DNA雙鏈斷裂，且該損傷與胃癌的形成密切相關[11]。胃與腸道是相鄰的上下消化道，有文獻報道了幽門螺桿菌感染胃部的同時造成了腸道炎癥，推測幽門螺桿菌對腸道細胞也造成了DNA雙鏈斷裂[12]。

1.2 腸道細胞DNA雙鏈斷裂應答機制

致病菌誘導宿主DNA雙鏈斷裂的同時觸發了機體DNA損傷修復（DNA damage repair，DDR）機制，在產生損傷標志物γH2AX的同時招募早期修復蛋白，即p53結合蛋白1進行DDR。一方面，發生DNA雙鏈斷裂的細胞通過激活非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復或同源重組（homologous recombination，HR）修復兩條互補競爭的通路進行快速修復或無損修復[13]，選擇何種修復方式主要取決于受損時的細胞周期。HR修復要求有同源DNA模板，常發生在姐妹染色體已形成的晚S期和G2期；NHEJ修復則主要對G1期和早S期的DDR負責。其中，NHEJ修復通路依賴DNA蛋白激酶DNA-PK磷酸化形成p-DNA-PKcs和p-Ku70/80，進而誘導下游DNA連接酶IV和X射線修復交叉互補蛋白4進行損傷修復[14]。HR修復通路則主要依賴上游“感應器”磷酸化形成磷酸化毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白（phosphorylated ataxia telangiectasia-mutated protein,p-ATM），進而調節下游BRCA1和RAD51/52等工具酶進行損傷修復[4]。另一方面，受損細胞啟動細胞周期檢查點（（checkpoint，CHK）1，CHK2）調節p53、p21等基因引起細胞周期阻滯和減緩細胞增殖，為DDR爭取時間[15]。幽門螺桿菌和大腸桿菌造成胃腸道DNA雙鏈斷裂后會引起短暫的染色體畸變，細胞周期阻滯于G2/M期，隨后分別激活細胞NHEJ和HR修復通路進行DDR[9,16]。若未及時進行DDR或修復精度不高則會引起基因組不穩定，腸道菌通過長期低劑量的基因損傷能促進宿主腫瘤或癌癥的形成。因此，探究有效緩解DNA雙鏈斷裂的食物成分對于預防DNA雙鏈斷裂造成的相關疾病具有重要意義。

2 食物成分對腸道細胞DNA雙鏈斷裂的保護作用及其機制

部分致病菌感染宿主可激活機體初級保護機制，即通過產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）來抑制致病菌，而ROS能夠同時引起宿主自身DNA雙鏈斷裂[16-17]。對于此類微生物造成的DNA雙鏈斷裂，具有抗氧化功能的食物成分可通過緩解氧化應激而起到緩解DNA雙鏈斷裂的效果；而對于非氧化脅迫引起的DNA雙鏈斷裂，食物成分還可通過調節DDR來提升損傷修復速率或精度進而起到緩解DNA雙鏈斷裂的效果。基于此，食物成分主要通過抗氧化作用、調節DDR和抗氧化的同時調節DDR 3 種機制發揮DNA雙鏈斷裂保護作用，且不同食物成分的作用機制和靶細胞存在差異（表1）。

表1 不同食物成分對細胞DNA雙鏈斷裂的保護作用Table 1 Protective effects of different food ingredients on cellular DSBs

2.1 抗氧化類食物成分

作為抗氧化劑，VC通過清除ROS為氧化應激造成的細胞損傷提供保護[29]。VE（α-生育酚）是一種人體必需的脂溶性抗氧化劑，可清除脂質環境中的過氧化氫自由基，在保護紅細胞膜和神經組織方面起重要作用。有文獻報道了VC和VE預防癌癥[30]和治療神經退行性疾病[31-32]的功能，而該功能的作用機制是否與保護宿主細胞DNA雙鏈斷裂相關尚未可知。值得注意的是，Brand等報道了VC、β-胡蘿卜素和VE具有緩解人外周血淋巴細胞DNA雙鏈斷裂的作用，其分別將DNA雙鏈斷裂標志物γ-H2AX灶點水平下調了25%、15%和12%，而不同抗氧化劑相互組合后未呈現疊加效應。該研究還通過體外實驗發現，此類抗氧化類物質對DNA雙鏈斷裂的緩解效果并非與作用時間呈線性相關，而是先呈正相關再呈負相關，提示抗氧化類食物對機體DNA雙鏈斷裂的保護作用具有時效性[18]。

國外有大量文獻報道了長期食用橄欖油具有延緩衰老的作用。Quiles等采用不同種類的油脂輔助飼喂大鼠24 個月，發現初榨橄欖油可直接調節大鼠血漿總抗氧化能力，進而緩解外周血淋巴細胞DNA雙鏈斷裂和調節脂質代謝水平，相比較而言，富含單不飽和油酸的橄欖油對機體DNA損傷更小，而富含多不飽和亞油酸的葵花籽油會造成細胞更為嚴重的DNA雙鏈斷裂[19]。體內外實驗均證實VC、VE和單不飽和油酸對淋巴細胞DNA雙鏈斷裂有緩解作用，有關其對腸上皮細胞DNA雙鏈斷裂的調節作用有待深入研究，以期為預防結直腸癌提供理論依據。

2.2 調節DDR類食物成分

腸道微生物引起的DNA雙鏈斷裂未及時修復或修復精度不高則會引起基因組不穩定，長期低劑量的DNA損傷將促進宿主腫瘤或癌癥的形成（圖1A）。與DDR調節相關的食物成分如葉酸具有緩解DNA損傷的作用，葉酸與DNA甲基化密切相關，葉酸攝入不足將造成DNA低甲基化并增加形成DNA損傷的風險。大量實驗證實，攝入足量葉酸對于維護體外細胞、動物和人體基因序列穩定性、DNA完整性和正常的DDR功能具有重要意義[33]。Sohn等發現大鼠連續5 周攝入葉酸雖然上調了結腸細胞p53基因轉錄水平，但對p53基因啟動子及外顯子第6～7個堿基的甲基化狀態并無顯著影響，推斷可能是p53基因外顯子第6～7個以外的甲基化與結直腸癌相關[20]。p53外顯子第5～8序列損傷的基因缺陷型大鼠攝入足量葉酸后，其患結腸癌風險降低，推測其作用機理在于葉酸通過小分子RNA（microRNAs，miRs）緩解了p53外顯子第5～8序列損傷，提升了p53基因完整性，故而促進DDR和緩解DNA雙鏈斷裂[21-22]（圖1B）。miRs在DDR的調控中起重要作用，食物類生物活性物質借助miRs影響大量基因的活性。大部分食物類生物活性物質通過6 個共同的miRs（miR-16、miR-25、miR-21、miR-181a、miR-146b和miR-34a）發揮基因調節作用[34]。其中，miR-21參與DNA損傷誘導的G2/M檢查點[35]，其對結腸癌細胞的細胞周期調控蛋白Cdc25A及細胞周期進程進行負調控[36]。miR-34家族是抑癌基因p53的直接轉錄靶點，miR-34a的激活使p53能夠調節大量DDR基因的表達[37]。反之，miR-34a基因的異位表達將下調一組促進細胞周期進展相關基因的表達并導致細胞在G1期發生阻滯[38-40]。

圖1 微生物對腸道細胞的DNA雙鏈斷裂（A）和食物成分對DNA雙鏈斷裂的調節作用（B）Fig.1 DSBs caused by microbes in intestinal cells (A) and regulatory effect of food ingredients on DSBs (B)

外源物質還可通過一類新的非編碼miRs，即DNA損傷反應RNAs（DNA damage response RNAs，DDRNAs）調節DNA雙鏈斷裂修復，該DDRNAs依賴于DNA雙鏈斷裂處產生的RNA水解酶DROSHA和DICER。如抗生素依諾沙星通過刺激DNA雙鏈斷裂的染色體和功能失調的端粒產生DDRNAs，該DDRNAs能夠促進損傷部位積累p53結合蛋白1并最終抑制HR修復，并將DNA修復方式轉變為NHEJ修復來快速修復神經元細胞的DNA雙鏈斷裂，緩解了小鼠神經退行性病變[41]。食物成分利用DDRNAs機制調控DNA損傷反應鮮見報道，有待進一步深入研究。

2.3 兼具抗氧化和調節DDR作用的食物成分

大量研究表明，多酚的強抗氧化作用有助于預防癌癥，而近年來研究發現，多酚對DDR的調節是其預防疾病的另一種機制（圖1B）。Charles等評價了12 種天然多酚（熊果苷、姜黃素、吲哚-3-甲醇、芹菜素、黃芩素、查耳酮、表兒茶素、染料木素、楊梅素、柚皮素、槲皮素和櫻桃紅）對DNA雙鏈斷裂損傷和癌癥的預防效果，其中5 種天然多酚（查耳酮、表兒茶素、楊梅素、櫻桃紅和熊果苷）明顯激活了正常人小腸細胞FHS 74 Int的NHEJ修復通路，并促進了DNA雙鏈斷裂處的末端連接，而另外3 種天然多酚（芹菜素、黃芩素和姜黃素）則抑制了DDR[23]。5 種天然多酚在體外實驗表現出其對NHEJ修復通路的激活效應，有關其在體內通過調節DDR來預防癌癥的作用機制值得進一步研究。

白藜蘆醇具有延緩衰老[26]和預防癌癥[27]的作用，已成為近年來研究的熱點。與上述5 種天然多酚作用機制不同的是，白藜蘆醇通過直接作用于ATM/共濟失調毛細血管擴張Rad3相關蛋白（Rad3-related protein，ATR）促使DDR從NHEJ轉向HR來提高淋巴細胞DNA雙鏈斷裂的修復效果[28]（圖1B）。對癌細胞而言，白藜蘆醇同樣通過直接激活ATM來調節p53基因表達，促進結腸癌細胞、肺癌細胞和腎癌細胞凋亡進而抑制癌細胞增殖和防止癌癥惡化[26]。

富含天然多酚的藍莓能夠有效地緩解癌癥等疾病，其作用機理之一是藍莓中花青素和花色苷的抗氧化作用[42]。然而，Liu Wei等研究發現藍莓不同組分（水提取物、甲醇提取物和乙醇提取物）不僅具有抗氧化作用還有調節DDR的功能[43]。其中，甲醇提取物（主要活性成分為花青素）通過活化p53基因來維護基因組穩定，但該研究使用的細胞模型為肝癌細胞，對于花青素在人體內是否會促進癌細胞DDR進而導致癌細胞增殖和癌癥惡化有待深入研究。因此，花青素的DNA雙鏈斷裂保護效果有待借助多種體內外模型進行全面評估。有研究指出，多酚只有在低劑量下才能更好地發揮防癌作用，劑量過高反而會對機體造成DNA損傷[44]。

丁酸作為一種短鏈脂肪酸能有效地維持人體細胞正常生理功能和預防人結腸細胞凋亡[45-46]。丁酸的結構決定了其不具備清除自由基的能力，有研究報道了其通過緩解氧化脅迫來保護DNA的作用，但其作用機理尚不清楚[47-49]。Toden等研究發現，抗性淀粉經腸道微生物代謝生成的丁酸緩解了大鼠結腸細胞DNA雙鏈斷裂[24]，可能是由于丁酸上調了p53非依賴性p21基因的表達，促進了DDR[25]（圖1B）。

3 益生菌對腸道細胞DNA雙鏈斷裂的保護作用

目前有關食物成分緩解人體和動物DNA雙鏈斷裂的報道并不多。因此，開發有效預防DNA雙鏈斷裂的新型資源是一個重要的研究方向。大量研究表明，益生菌可通過抑菌作用、增強機體免疫和改變腸道屏障通透性等多種機制來改善腸道功能和緩解腸道疾病[50-53]，因此，微生態制劑的開發成為當前研究的熱點。已有研究報道了益生菌對人體和動物DNA損傷的保護作用，主要集中于乳酸菌對宿主DNA單鏈斷裂損傷修復的調節[54-56]，其對開發有效緩解DNA雙鏈斷裂的益生菌具有深遠意義。1）益生菌具有抗氧化作用。不同的益生菌菌株可通過不同機制抵抗ROS，包括過氧化自由基、超氧陰離子自由基以及羥自由基[57-58]。益生菌的抗氧化機制包括自身的抗氧化物酶（超氧化物歧化酶和過氧化氫酶）、抗氧化代謝產物（谷胱甘肽）和調節人體或動物體內的抗氧化信號通路（核因子E2相關因子2-胞質伴侶蛋白-抗氧化反應元件和核因子κB）等[59]。如動物雙歧桿菌01株的培養上清液、完整細胞和細胞內提取物均可清除羥自由基與超氧陰離子自由基，提升小鼠體內抗氧化酶活性，增強小鼠的抗衰老能力[60]。此外，益生菌還可通過發酵底物來提升抗氧化活性，用4 種瑞士乳桿菌953、474、1188、1315發酵牛奶可以不同程度地釋放多種生物活性化合物，此類化合物顯著提升了發酵奶的抗氧化活性和預防結腸癌的潛力[61]。2）益生菌代謝生成具有DDR調節功能的葉酸。雙歧桿菌屬具有合成葉酸的能力，這些菌株大部分屬于青春雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌。用此類益生菌制劑飼喂大鼠能夠提升其血漿的葉酸水平，證實此類益生菌定植大鼠腸道后代謝生成葉酸并被機體吸收。進一步將該制劑用于人體實驗發現，益生菌制劑提升了人糞便中的葉酸濃度[62]。此外，植物乳桿菌由于能夠合成對氨基苯甲酸故而也能代謝產生葉酸。3）益生菌代謝生成具有DDR調節功能的丁酸。益生菌在腸道內發酵產生多種短鏈脂肪酸，其中丁酸占5%[63]，結腸細胞能量的70%依賴于丁酸[64-65]，丁酸鹽在促進正常結腸上皮細胞生長的同時還可誘導大腸癌細胞凋亡[66]。雙歧桿菌和產丁酸菌交叉飼喂可提高人體腸道丁酸鹽水平和預防結直腸癌，除雙歧桿菌外，丁酸產生菌還包括普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）、丁酸弧菌屬（Anaerostipes）、優桿菌屬（Eubacterium）和羅斯氏菌屬（Roseburia）[67]。因此，盡管鮮有益生菌緩解宿主細胞DNA雙鏈斷裂的報道，益生菌的抗氧化活性、代謝生成葉酸和丁酸等性質決定了其具有緩解宿主細胞DNA雙鏈斷裂的潛能，有關其對體內外細胞DNA雙鏈斷裂的緩解效果有待進一步研究。

4 結 語

腸道細胞的DNA雙鏈斷裂與腫瘤和癌癥的形成密切相關，食物成分可通過緩解宿主腸上皮細胞DNA雙鏈斷裂起到預防結直腸癌的作用。食物成分發揮DNA雙鏈斷裂保護作用的機制包括抗氧化作用、調節DDR和抗氧化同時調節DDR。應注意的是，此類食物成分的攝入具有特殊性，對正常細胞DNA雙鏈斷裂具有緩解作用的食物成分作用于非正常細胞（如癌細胞）時，可能會促進癌細胞的增殖。因此，有關此類食物成分的功能研究應囊括正常細胞模型和癌細胞模型，以更全面地評價其維護機體健康的效果。此外，此類食物成分對DNA雙鏈斷裂的保護效果與攝入劑量和攝入時間有關，因此，在設計體內實驗時還應考察不同劑量和攝入時間的影響以獲得最佳保護效果。基于已報道的食物成分對DNA雙鏈斷裂的保護機制，結合益生菌自身抗氧化和代謝生成葉酸和丁酸的特征，推斷益生菌具有緩解DNA雙鏈斷裂的潛能，揭示益生菌有維護宿主基因組穩定的功能。在將來的研究中，應對于此類功能益生菌進行深入研究，為進一步開發預防基因疾病的益生菌類保健食品提供理論依據。