牛至精油微膠囊的制備、表征及在杏貯藏期的抑菌效果

石澤棟，蔣雅萍，孫英杰，李富軍，閔德棟，張新華，李曉安

（山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

腐爛是導致果蔬采后損失的重要因素。生產(chǎn)上通常采用化學殺菌劑來殺滅腐爛致病菌，以降低和減少果蔬腐爛。然而，傳統(tǒng)的果蔬化學殺菌劑具有農(nóng)藥殘留，過量使用時會給人們身體健康和生態(tài)環(huán)境帶來嚴重的威脅。隨著人們對身體健康和環(huán)境安全的日益關(guān)注，化學殺菌劑在越來越多的國家中受到限制[1]。因此，開發(fā)綠色、環(huán)保、低毒甚至無毒的非化學殺菌劑，以延長水果和蔬菜的貯藏期，是果蔬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求[2]。植物精油具有廣譜殺菌、生物降解、安全無毒等優(yōu)點，具備作為綠色果蔬殺菌劑的特性，在果蔬中進一步應(yīng)用的優(yōu)勢和潛力明顯[3]。

牛至是唇形科牛至屬植物，具有清熱、化濕、祛暑、解表、理氣、抑菌殺菌的功效，在世界范圍內(nèi)被用作醫(yī)藥和保健品的原料。牛至精油主要是從牛至植物的根、莖、葉中提取純化得到的黃紅色或棕紅色精油，有效成分主要是香芹酚和百里酚[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油不僅對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌等有很好的抑制作用，而且對霉菌也能起到很強的抑制作用[6]。此外，牛至精油還具有很強的抗氧化能力，將牛至精油應(yīng)用到果蔬的殺菌保鮮中，有望起到良好的抑菌效果[7-8]。

目前，常見的植物精油處理果蔬的方式主要有涂抹[9]、噴灑[10]和熏蒸[11]。這些技術(shù)具有使用效果好、見效快的優(yōu)點。但多數(shù)植物精油具有特殊的氣味，同時，因直接使用時揮發(fā)較快，殺菌效果不持久。微膠囊技術(shù)可以將液態(tài)的植物精油固態(tài)化，既能降低環(huán)境因素對芯材的影響，增強其穩(wěn)定性，還能將芯材緩慢釋放，延長牛至精油的作用時間，起到持續(xù)殺菌的效果[12-13]。這些結(jié)果都為植物精油微膠囊化在果蔬貯藏保鮮和殺菌中的應(yīng)用提供了新的方法和思路[14]。

本實驗以牛至精油為芯材，以明膠、阿拉伯膠為壁材，采用復(fù)凝聚法，通過工藝優(yōu)化制備了牛至精油微膠囊，并對其理化特征和緩釋性能進行了表征，最后評估了牛至精油微膠囊在杏保鮮過程中的抑菌效果，以期為植物精油在果蔬抑菌保鮮中的應(yīng)用，以及開發(fā)綠色環(huán)保的植物精油微膠囊保鮮殺菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏（Armeniaca vulgarisLam.）（品種為‘鄒平水杏'，采收時可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)≥12%，硬度平均值1.4 kg/cm2，果實表面積超過80%開始轉(zhuǎn)黃）采自山東省淄博市張店區(qū)。

明膠、阿拉伯膠（化學純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛至精油（純度98%） 上海源葉生物科技有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（食品級，100 U/g）江蘇一鳴生物股份有限公司；冰乙酸（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；氫氧化鈉（分析純） 天津市凱通化學試劑有限公司；無水硫酸鈉（分析純） 天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2102PCS紫外分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；MULtiskan GO全波長酶標儀 賽默飛世爾科技（上海）有限公司；SG-540 4C數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海碩光電子科技有限公司；FJ200-S數(shù)顯高速分散機 上海標本模型廠；PB-10 pH計 上海摩速科學器材有限公司；FD-1A-80冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；MS2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；Sirion200掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） FEI（美國）有限公司；570傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國熱電尼高力儀器有限公司；STA-449F3熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）儀 德國耐馳公司；Q2000差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 牛至精油最大吸收波長確定及標準曲線的繪制

用無水乙醇將牛至精油稀釋至一定濃度，在200～1 000 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，以無水乙醇作為空白對照，測定牛至精油的最大吸收波長。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛至精油在277 nm波長處有最大吸收峰，該波長可用于測定微膠囊的包埋率。

用無水乙醇將牛至精油分別稀釋至不同濃度梯度（0.2、0.4、0.6、1.0、1.2 μL/mL），在牛至精油最大吸收波長處測定其不同濃度時的吸光度，以無水乙醇作為空白對照，繪制標準曲線，標準曲線方程為y＝0.426 1x－0.000 9，R2＝0.999 5。

1.3.2 牛至精油微膠囊的制備及實驗設(shè)計

1.3.2 .1 牛至精油微膠囊的制備流程

采用復(fù)合凝聚法制備牛至精油微膠囊。將明膠和阿拉伯膠分別溶解，然后混合均勻，在混合溶液中加入適量的牛至精油，1 000 r/min離心3 min，用體積分數(shù)10%的冰乙酸溶液調(diào)pH值至4.0，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min后取出，冰水浴降溫至10 ℃左右，用10 g/100 mL的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.0，設(shè)置反應(yīng)溫度為50 ℃，加入一定量的固化劑——谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，繼續(xù)攪拌固化3 h，靜置抽濾，得到濕囊產(chǎn)物。將微膠囊濕囊平鋪在培養(yǎng)皿中，在冰箱中預(yù)冷24 h，然后冷凍干燥24 h，得到固態(tài)微膠囊。

1.3.2 .2 單因素及正交試驗設(shè)計

以牛至精油為芯材，以明膠、阿拉伯膠為壁材，壁材質(zhì)量比（明膠、阿拉伯膠質(zhì)量比）分別為1∶2、1∶1、3∶2、4∶2、5∶2，芯材與壁材質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，反應(yīng)溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，反應(yīng)時間分別為10、20、30、40、50 min，固化時間分別為1、2、3、4、5 h，固化劑與明膠質(zhì)量比為1∶4，測定牛至精油微膠囊包埋率的大小。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取壁材質(zhì)量比A、芯材與壁材質(zhì)量比B、反應(yīng)溫度C、反應(yīng)時間D4 個因素進行正交試驗，優(yōu)化牛至精油微膠囊的制備工藝參數(shù)，因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.3 牛至精油微膠囊的理化特性測定

1.3.3 .1 包埋率和載油率測定

微膠囊的包埋率定義為微膠囊中的芯材與原始乳液中的芯材質(zhì)量的比值。微膠囊的載油率定義為微膠囊中芯材與壁材質(zhì)量的比值。按照公式（1）、（2）分別計算包埋率和載油率。

式中：V1為微膠囊總油的體積/mL；V2為微膠囊表面油體積/mL；m為微膠囊粉末的質(zhì)量/g；ρ為牛至精油的密度/（g/mL）。

微膠囊總油含量的測定：稱取0.1 g凍干的牛至精油微膠囊粉末，用10 mL無水乙醇充分浸泡，用超聲細胞破碎儀在20 ℃和功率為200 W條件下對混合物進行超聲處理10 min，然后靜置2 h，過濾，將濾液補足至20 mL，并在277 nm波長處測定其吸光度，根據(jù)1.3.1節(jié)中標準曲線計算微膠囊總油含量。

微膠囊表面油含量的測定：稱取0.1 g凍干的牛至精油微膠囊粉末，用10 mL無水乙醇快速洗滌，然后過濾得到濾液，最后將濾液補足至20 mL，并在277 nm波長處測定其吸光度。根據(jù)1.3.1節(jié)的標準曲線計算表面油含量。

1.3.3 .2 粒徑測定

參照Bae等[15]的方法，以蒸餾水為分散劑，使用激光粒度儀測定微膠囊的粒徑，儀器設(shè)定分散劑折射率1.33、樣品折射率1.59、樣品吸收率0%、分析模型為通用型。

1.3.3 .3 傅里葉變換紅外光譜分析

參照Zhang Dongliang等[16]的方法，采用FTIR儀對樣品進行測定。取適量的樣品，加入溴化鉀粉末進行充分研磨，然后用壓片機壓成透明片狀，置于FTIR儀中，在波長500～4 000 cm－1范圍內(nèi)進行掃描，分辨率為0.09 cm－1。

1.3.3 .4 掃描電子顯微鏡觀察

參照Tu Xiaofang等[17]的方法，在樣品臺上貼一層導電膠帶，將凍干后的微膠囊粉末均勻地撒在上面，然后吹走過多的粉末，噴金處理，用SEM觀察和拍照。

1.3.3 .5 熱重分析

參照Martelli-Tosi等[18]的方法，采用TGA儀測定樣品的熱釋放曲線。設(shè)置參數(shù)：初始溫度25 ℃、終止溫度500 ℃、升溫速率20 ℃/min、載氣為氮氣、流量30 mL/min。

1.3.3 .6 差示掃描量熱分析

參照Arfat等[19]的方法，使用DSC儀測定樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（glass transition temperature，Tg）。將樣品加到DSC樣品盒中，以空白盒作為參考，設(shè)置初始溫度0 ℃、終止溫度100 ℃、升溫速率10 ℃/min。

1.3.4 牛至精油微膠囊釋放性能研究

分別在光照（自然光）或避光（25 ℃、有氧）、4 ℃或25 ℃（避光、有氧）以及有氧或無氧（25 ℃、避光）條件下，將相同質(zhì)量的牛至精油微膠囊貯藏30 d，每5 d測定一次牛至精油的釋放率，每組測定重復(fù)3 次。牛至精油的釋放率按公式（3）計算。

式中：V1為初始微膠囊牛至精油體積/mL；Vt為第t天微膠囊牛至精油體積/mL。

1.3.5 牛至精油微膠囊在杏貯藏保鮮中的抑菌效果研究

1.3.5 .1 杏果實的處理

選擇大小、顏色均一、無病蟲害、無機械損傷的杏果實，隨機分為3 個處理組和1 個對照組，每組一共360 個果實（平均放入6 個塑料桶，并編號1～6）。對于3 個處理組，分別加入2%（以果實質(zhì)量計，下同）、4%、8%的凍干牛至精油微膠囊粉末（將凍干的牛至精油微膠囊粉末放入無紡布做成的透氣小布袋中，置于杏果實底部），對照組加入不含牛至精油的空殼微膠囊。最后，將所有塑料桶口用塑料薄膜（每平方厘米內(nèi)預(yù)先打一個直徑為0.1 mm的孔）密封，然后室溫下放置。其中，每組編號1～3的用于定期取樣測定菌落總數(shù)和相關(guān)酶的活力；編號4～6的用于計算果實腐爛率。

1.3.5 .2 菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)的測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》，采用平板計數(shù)法計算菌落總數(shù)[20]；參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》，采用平板計數(shù)法計算霉菌總數(shù)[21]。

1.3.5 .3 杏果實腐爛率的測定

參照Min Dedong等[22]的方法，每隔5 d測定一次杏果實的腐爛率，目測果實表皮有明顯的霉變、軟腐或病斑，即為腐爛果實，并根據(jù)公式（4）計算腐爛率。

1.3.5 .4 杏果實病害相關(guān)酶活力的測定

在定期取樣測定菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)后，取樣用液氮冷凍后存放于－80 ℃冰箱中，以備確定最優(yōu)實驗設(shè)計后測定酶活力。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力參照Liu Hongxia等[23]的方法，該反應(yīng)體系包括0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、0.1 mol/L鄰苯二酚和0.5 mL酶提取物，實驗測定吸光度的波長為420 nm。過氧化物酶（peroxidase，POD）活力測定參照Luo Zisheng等[24]的方法并稍加改動，將0.2 mL酶提取物添加到4.4 mL磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L磷酸鈉、pH 6.8 0.4 mL愈創(chuàng)木酚、0.2 mL H2O2）中，并記錄在470 nm波長處的吸光度。一個PPO、POD活力單位（U）被定義為每克新鮮杏果實在相應(yīng)波長處每分鐘吸光度變化0.01。

L-苯丙氨酸氨解酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力參照Luo Zisheng等[24]的方法并稍加修改。反應(yīng)體系包含0.2 mol/L的硼酸鈉緩沖液、20 mmol/L的L-苯丙氨酸和0.5 mL的酶提取物。37 ℃下孵育1 h后，在290 nm波長處測定吸光度。一個PAL活力單位（U）被定義為每克鮮果實反應(yīng)體系每小時吸光度變化0.01。

β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）和幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）活力參照Cao Jiankang等[25]的方法，對于GLU，將50 μL的酶提取物與25 μL質(zhì)量分數(shù)0.4%褐藻多糖混合，在37 ℃孵育40 min。然后加入200 μL 3,5-二硝基水楊酸鹽，在100 ℃沸水中加熱3 min，終止反應(yīng)。在500 nm波長處測定吸光度。一個GLU活力單位（U）定義為每秒每克鮮果實酶分解褐藻多糖產(chǎn)生10－9mol葡萄糖。對于CHI測定，將0.5 mL的酶提取物與0.5 mL的膠質(zhì)幾丁質(zhì)混合，并在37 ℃下孵育1 h，然后在10 000×g下離心10 min。然后將上清液（1 mL）與0.1 mL的3 g/100 mL蝸牛酶混合，在37 ℃下孵育1 h。通過添加0.2 mL的0.6 mol/L四硼酸鉀溶液并煮沸5 min，終止反應(yīng)。冷卻后，將溶液與2 mL的體積分數(shù)4%的4-二甲基氨基苯甲醛混合，并在37 ℃下溫育10 min。在585 nm波長處測定吸光度。一個CHI活力單位（U）被定義為每秒每克鮮果實分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生10－9mol的N-乙酰基-D-葡糖胺。

過氧化氫酶（catalase，CAT）活力參照Luo Zisheng等[26]的方法稍加修改。將樣品在裝有pH 7.8 50 mmol/L磷酸鈉緩沖液的研缽中勻漿。反應(yīng)體系包含1.5 mL的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.8）、1 mL蒸餾水、0.3 mL 0.1 mol/L H2O2和0.2 mL的酶提取物。一個CAT活力單位（U）定義為每克鮮果實在240 nm波長處每分鐘吸光度變化0.1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3 次，采用Origin 9.0軟件作圖，采用Excel 2010軟件和SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。通過ANOVA進行方差分析和Duncan多重比較程序進行顯著性差異分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗及正交試驗結(jié)果

如圖1所示，單因素試驗結(jié)果表明，各單因素條件下，當壁材質(zhì)量比為1∶1、芯材與壁材質(zhì)量比為1∶1、反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時間為30 min、固化時間為3 h時，牛至精油微膠囊的包埋率分別達到最高。

圖1 不同因素對牛至精油微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effects of different variables on the microencapsulation rate of OEO-MPs

在單因素試驗基礎(chǔ)上進行了正交試驗，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，影響包埋率的4 個因素從大到小依次為芯材與壁材質(zhì)量比＞壁材質(zhì)量比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時間，最終確定最佳的工藝條件組合為A2B2C1D2。對最優(yōu)的工藝條件進行驗證，重復(fù)3 次，結(jié)果均與最優(yōu)工藝條件的組合相同。由此確定最優(yōu)工藝條件為：芯材與壁材質(zhì)量比1∶1、壁材質(zhì)量比1∶1、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時間30 min。在此工藝條件下，制備了牛至精油微膠囊，對此精油進行表征，并利用其對杏進行貯藏期實驗。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

2.2 牛至精油微膠囊的理化特性與緩釋性能

2.2.1 牛至精油微膠囊的包埋率、載油率、粒徑分布及傅里葉變換紅外光譜

通過最優(yōu)工藝條件制備的牛至精油微膠囊，其包埋率為83.65%，載油率為74.36%。如圖2A所示，牛至精油微膠囊粒徑分布均勻，平均為147 μm。粒徑分布均勻可能與兩個因素有關(guān)：一個是機械強度，高剪切力可以促進牛至精油的乳化，形成較小的膠束，最后形成均勻的乳液[27]；另一個是溶液的pH值，因為微膠囊制備過程中pH值的變化可能導致阿拉伯樹膠的Zeta-電位發(fā)生變化，當帶電陰離子的數(shù)量增加時，微膠囊之間的排斥力會增加，微膠囊之間聚集程度降低，從而形成較小的顆粒。

明膠、阿拉伯膠、牛至精油和牛至精油微膠囊的FTIR圖如圖2B所示。明膠的特征吸收峰有氨基N—H伸縮振動峰（3 446.33 cm－1）、烷基C—H（2 959.11 cm－1）伸縮振動峰、酰胺鍵中C—N伸縮振動峰（1 284.85 cm－1）、酰胺羰基C＝O伸縮振動峰（1 630.41 cm－1）。當pH值低于明膠等電點時，氨基與氫離子結(jié)合使溶液中—NH4+的數(shù)目多于—COO－，此時，明膠總體帶正電[28]；C—N伸縮振動峰與C＝O伸縮振動峰與典型的酰胺I譜帶（1 600～1 700 cm－1）吻合，這也是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)成分中最敏感的光譜區(qū)域。阿拉伯膠的特征吸收峰有烷基C—H伸縮振動峰（2 934.66 cm－1）、羧基不對稱伸縮振動峰（1 617.84 cm－1）、羧基對稱伸縮振動峰（1 422.76 cm－1）。牛至精油的特征吸收峰包括黃酮類物質(zhì)—OCH2的伸縮振動吸收峰（2 960 cm－1）、酸酐振動吸收峰（1 722 cm－1）、醚類物質(zhì)的振動吸收峰（1 252 cm－1）[29]。牛至精油微膠囊的特征吸收峰只有黃酮類物質(zhì)—OCH2的伸縮振動吸收峰（2 961 cm－1）和醚類物質(zhì)的振動吸收峰（1 255 cm－1），說明制備的微膠囊中含有牛至精油；而牛至精油的酸酐振動吸收峰未出現(xiàn)，說明微膠囊并不是壁材與芯材的簡單物理混合物，并且形成的微膠囊中未發(fā)現(xiàn)新的特征吸收峰，說明在復(fù)凝聚反應(yīng)過程中未形成新的化學鍵；此外，牛至精油微膠囊中明膠的氨基吸收峰（3 446 cm－1）和阿拉伯膠的羧基吸收峰（1 617、1 422 cm－1）消失。上述結(jié)果表明，壁材之間發(fā)生相互作用，并將芯材進行了包埋，且在該反應(yīng)過程中未改變壁材和芯材的化學性質(zhì)。

圖2 牛至精油微膠囊的粒徑分布（A）和FTIR（B）圖Fig.2 Particle size distribution (A) and FTIR spectrum (B) of OEO-MPs

2.2.2 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

通過SEM觀察冷凍干燥后微膠囊的表面形態(tài)，結(jié)果如圖3所示。空白微膠囊（圖3A）表面有凹陷，且成片狀聚集，這可能是因為在冷凍干燥過程中微膠囊內(nèi)部水分揮發(fā)，壁材發(fā)生皺縮凹陷，最終形成片狀[30]。牛至精油微膠囊（圖3B）表面同樣具有褶皺，這與空白微膠囊表面的凹陷原因相同；與空白微膠囊不同的是，牛至精油微膠囊的囊壁結(jié)構(gòu)比較完整，表面光滑且沒有產(chǎn)生空洞和破裂。這可能是由于加入了谷氨酰胺酶作為固化劑：谷氨酰胺酶通過與果膠分子間形成共價鍵，催化蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，從而維持微膠囊的形態(tài)[31]。這說明微膠囊化對芯材產(chǎn)生了良好的保護作用。

圖3 空白微膠囊（A）和牛至精油微膠囊（B）的SEM圖Fig.3 SEM of blank MPs (A) and OEO-MPs (B)

2.2.3 熱重分析結(jié)果

TG分析是指在程序控制溫度下測量待測樣品的質(zhì)量與溫度變化關(guān)系的一種熱分析技術(shù)，用來研究材料的熱穩(wěn)定性及推測在此過程中組分的物理化學變化。對牛至精油的TG分析表明，在120 ℃左右時，牛至精油開始發(fā)生分解，直到260 ℃左右，其質(zhì)量損失約98.91%，幾乎全部損失，充分體現(xiàn)了芯材易揮發(fā)的特點。相比而言，壁材則具有較高的穩(wěn)定性，明膠和阿拉伯膠在210 ℃左右時，質(zhì)量損失分別約為8%和5%，當溫度達到500 ℃左右時，明膠質(zhì)量剩余21.43%，阿拉伯膠剩余28.54%（圖4A）。

圖4 不同微膠囊的TGA曲線（A）和牛至精油微膠囊的DSC曲線（B）Fig.4 TGA curves of different microcapsules (A) and DSC curve of OEO-MPs (B)

牛至精油微膠囊和空白微膠囊的熱分解過程主要分為4 個階段：第一階段（25～100 ℃），此時兩者的質(zhì)量損失約3%，這是微膠囊中的水分的蒸發(fā)所導致的[32]；第二階段（100～200 ℃），空白微膠囊的質(zhì)量損失約3%，而牛至精油微膠囊的質(zhì)量損失約20%，而純牛至精油損失約41%，這證明了壁材對芯材起到了很好的保護作用；微膠囊的熱分解主要發(fā)生在第三階段（200～350 ℃），此階段中，空白微膠囊和牛至精油微膠囊的質(zhì)量損失分別約42%、40%，這可能是因為明膠和阿拉伯膠之間由于靜電相互作用形成的共價鍵遭到破壞，芯材被不斷分解釋放，且根據(jù)以前的報道，明膠在275～375 ℃發(fā)生分解，壁材也在逐漸分解[33]；第四階段（350～500 ℃），兩者的質(zhì)量損失約為18%，該階段芯材已經(jīng)完全被釋放，基本上都是壁材的分解。上述結(jié)果表明，由于壁材的保護，大大降低了精油的分解速率，牛至精油微膠囊表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性。

2.2.4 差示掃描量熱分析結(jié)果

溫度對微膠囊的穩(wěn)定性有顯著影響，溫度的改變會影響壁材和芯材的性質(zhì)。隨著溫度的升高，微膠囊狀態(tài)一般分為4 個階段：玻璃態(tài)、黏彈態(tài)、高彈態(tài)和黏流態(tài)。Tg是玻璃態(tài)向高彈態(tài)轉(zhuǎn)變時的材臨界溫度。當聚合物處于玻璃態(tài)時，運動程度最小，貯藏穩(wěn)定性也最高。在貯藏過程中，當微膠囊溫度高于Tg時，壁材和芯材的性質(zhì)會發(fā)生改變，迅速從玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變成黏彈態(tài)，再轉(zhuǎn)變?yōu)楦邚棏B(tài)直至黏流態(tài)，此過程會導致芯材的快速釋放。如圖4B所示，牛至精油微膠囊的Tg是48.04 ℃，高于正常室溫（25 ℃）。這表明在常溫條件下，牛至精油微膠囊比較穩(wěn)定。

2.3 牛至精油微膠囊貯藏穩(wěn)定性

本實驗還進一步研究了溫度、光照、氧氣對牛至精油微膠囊穩(wěn)定性的影響。在貯藏30 d時，在4 ℃和25 ℃條件下，牛至精油微膠囊的精油釋放率分別為11.1%和18.3%，這表明貯藏溫度越高，芯材的保留率越低（圖5A）；在避光和光照條件下，貯藏30 d時，其釋放率分別為16.5%和21.0%（圖5B）；在無氧和有氧的條件下，貯藏30 d時，其釋放率分別為21.1%和25.0%（圖5C）。因此，牛至精油微膠囊適宜在低溫、避光、無氧的環(huán)境下貯藏。

圖5 溫度（A）、光照（B）、氧氣（C）對牛至精油微膠囊釋放性能的影響Fig.5 Effects of temperature (A), light (B) and oxygen (C) on the release performance of OEO-MPs

2.4 牛至精油微膠囊對杏貯藏保鮮的殺菌效果

2.4.1 杏果實微生物總數(shù)及腐爛率

如表3所示，在貯藏20 d的過程中，微生物總數(shù)隨時間的延長均呈現(xiàn)上升的趨勢。在貯藏時間相同的條件下，4%、8%牛至精油微膠囊處理組的菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)均顯著低于對照組（P＜0.05），這表明牛至精油微膠囊具有明顯的抑菌效果。這是因為牛至精油的有效成分——香芹酚和百里酚會與細菌細胞膜上的磷脂雙分子層作用，從而使細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能紊亂[34]。在貯藏期內(nèi)，3 個處理組在菌落總數(shù)上也有顯著差異（P＜0.05），添加量為4%的牛至精油微膠囊表現(xiàn)出更顯著的抑菌效果。

表3 牛至精油微膠囊對杏果實微生物總數(shù)和腐爛率的影響Table 3 Effects of OEO-MPs on the total number of microorganisms and decay incidence in apricot fruit

微生物是引起果蔬腐爛的重要因素，其中根霉、灰霉等霉菌是導致杏在采收后發(fā)生軟腐病、褐腐病的主要原因。本課題組前期的研究表明，牛至精油可以有效抑制灰霉、青霉等的生長[35]。在處理第5天時，3 個處理組均未出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，而對照組中的果實發(fā)生腐爛，這表明了微膠囊能夠延長杏的貯藏期。其中，在相同貯藏時間內(nèi)，添加量為4%牛至精油微膠囊處理的果實腐爛率最低，這與其抑菌效果相一致。與4%牛至精油處理的果實相比，添加量為8%的牛至精油微膠囊處理并沒有進一步減輕果實的腐爛率。因此推測這可能與微膠囊過量使用誘發(fā)果實藥害有關(guān)。因此，添加量為4%微膠囊處理能夠抑制微生物的增長，降低腐爛率，延長杏的貯藏時間。

2.4.2 杏果實病害相關(guān)酶活力

POD、PPO、CAT、PAL、GLU和CHI是果實生長發(fā)育過程中重要的病害相關(guān)酶，它們的活性與果實的抗病性密切相關(guān)。POD、GLU和CHI都屬于病程相關(guān)（pathogenesis-related，PR）家族蛋白，而PR家族蛋白可以直接降解病原體的細胞壁或通過間接釋放防御反應(yīng)寡糖引發(fā)劑來降解細胞壁[36]。

在篩選出牛至精油微膠囊添加量為4%時具有最優(yōu)抑菌效果的基礎(chǔ)上，以加入不含牛至精油的空殼微膠囊為對照，進一步分析了4%牛至精油微膠囊處理對果實病害相關(guān)酶活力的影響，結(jié)果見圖6。4%牛至精油微膠囊明顯提高了POD、GLU、CHI活力。PPO負責將酚類化合物氧化為鄰奎寧，導致水果和蔬菜褐變[37]。在貯藏第6天時，兩組PPO活力達到最大值，且牛至精油微膠囊處理組的PPO活力明顯低于對照組，證明4%牛至精油微膠囊可以降低杏的PPO活力。CAT參與活性氧的代謝，PAL是木質(zhì)素、單寧等的主要合成酶[38]，相比對照組，4%牛至精油微膠囊明顯提高了兩種酶的活力。因此，4%牛至精油微膠囊能夠提高POD、CAT、PAL、GLU和CHI活力，降低PPO活力，從而誘導杏果實的防御機制，增強杏果實在貯藏期間的抗病能力。

圖6 添加量4%牛至精油微膠囊對杏果實貯藏期病害相關(guān)酶活性的影響Fig.6 Effects of 4% OEO-MPs on disease-related enzyme activities in apricot fruit during shelf life

3 結(jié) 論

本實驗通過復(fù)合凝聚法成功制備了以明膠和阿拉伯膠為壁材的牛至精油微膠囊，表征了其理化特性和緩釋性能，并評估了其在杏果實貯藏過程中的殺菌效果和對抗病相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明，牛至精油微膠囊制備的最佳工藝條件為：芯材與壁材質(zhì)量比1∶1、壁材質(zhì)量比1∶1、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時間30 min。最優(yōu)工藝條件下制備的牛至精油微膠囊包埋率為83.65%，載油率為74.36%，平均粒徑為147 μm。TGA、DSC、貯藏穩(wěn)定性分析和SEM觀察結(jié)果表明，牛至精油微膠囊具有良好的熱穩(wěn)定性、規(guī)則的表面結(jié)構(gòu)，在低溫、避光和無氧條件下具有良好的緩釋性能。在杏貯藏期間，添加量為2%、4%、8%的牛至精油微膠囊均具有明顯的抑菌效果，其中，添加量為4%時，牛至精油微膠囊顯著減少了杏果實貨架期間表面的微生物總數(shù)，提高了杏貯藏期內(nèi)POD、CAT、PAL、GLU和CHI活性，降低了PPO活性，從而降低了杏果實的腐爛率。因此，將牛至精油固態(tài)化可以更方便、有效地應(yīng)用于杏果實的殺菌和保鮮，并起到長效殺菌的效果。該結(jié)果為今后基于植物精油的綠色果蔬殺菌保鮮劑的開發(fā)提供了參考。