不飽和脂肪酸室溫氧化過程中自由基的變化

王蒙蒙，寇宇星,2，周 笙，王莉倩，于修燭,

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240）

食用油室溫氧化以不飽和脂肪酸的自動氧化為主，自動氧化以自由基為活性中間體，通過自由基鏈式反應進行[1-3]。不飽和脂肪酸（RH）被引發生成烷基自由基（R·），R·與氧氣反應生成烷過氧自由基（ROO·），其性質活潑，會攻擊新的RH產生R·，從而促進鏈增殖，其間伴隨脂質氫過氧化物（ROOH）的生成和裂解，產生小分子物質等，造成油脂酸敗變質[4-6]。抗氧化劑（如自由基清除劑、單線態氧淬滅劑、金屬離子螯合劑）會降低油脂的氧化速率[7-10]；酚類化合物如特丁基對苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）、生育酚（tocopherol，VE），可提供氫原子（H·）與ROO·或烷氧自由基（RO·）反應，抑制鏈引發和增殖[11-13]。氧化助劑（如過渡金屬離子、葉綠素）會促進油脂氧化；偶氮二異庚腈（2,2'-azobis(2,4-dimethyl)valeronitrile，ADVN）熱分解引發的自由基與氧反應生成過氧自由基，其會攻擊不飽和脂肪酸從而引發自動氧化反應[14]；葉綠素可以激活單線態氧直接與脂肪酸的雙鍵加成生成氫過氧化物，或者通過提取氫質子直接活化含烯物生成自由基，進而與氧反應[15]。電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）結合自旋捕獲技術可用于檢測性質活潑、不穩定的自由基，直接有效且快速靈敏[16-18]，其在脂質氧化方面應用漸多。Chen Hongjian等[19]用EPR監測140 ℃熱氧化的油酸，發現5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5,5-dimethyl-1-pyrrolineN-oxide，DMPO）-烷基自由基加合物是主要組成部分，EPR譜強度遠高于烷氧基。Xie Yunfei等[20]研究了花生油氧化過程中脂質自由基變化，在90 ℃加速氧化過程中，油酸和亞油酸中所含自由基主要是R·，花生油中所含自由基主要是未知碳中心自由基（DMPO-X）和RO·。加入TBHQ和檸檬酸的花生油中自旋總數顯著降低[21]。適量濃度生育酚會抑制N-叔丁基-α-苯基硝酮脂質加合物生成，過量則會促進生成[22]。此外，利用EPR中自由基急劇變化確定氧化誘導時間，也可判斷油脂的氧化穩定性[23-26]。Liu Ying等[27]進行的50 h油炸實驗中，EPR結果與大豆油過氧化值呈現良好的線性關系，表明EPR可以提供油炸體系脂質氧化的有效信息。本研究通過EPR技術對不飽和脂肪酸室溫氧化過程自由基變化及TBHQ、VE、ADVN、葉綠素對其影響進行探究，結合不飽和脂肪酸核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）分析脂肪酸氧化變化，探究不飽和脂肪酸室溫氧化過程主要自由基的變化規律，并從自由基層面來明確抗/促氧化劑對其自動氧化的作用效果，為減輕不飽和脂肪酸氧化，延緩不同種類食用油氧化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油酸（分析純）、亞油酸（純度≥99.0%）、亞麻酸（純度≥99.0%）、DMPO、VE、TBHQ、ADVN阿拉丁試劑（上海）有限公司；甲苯（分析純） 天津科密歐化學試劑有限公司。

DMPO溶液的配制：將新購入的DMPO用甲苯溶解，使其終濃度為2.0 mol/L，置于棕色試劑瓶中，在－20 ℃冰箱中避光密封保存待用。

葉綠素制備：取5 g新鮮菠菜，去莖取葉，洗凈剪碎，放入研缽中充分研磨，用20 mL無水乙醇室溫浸泡1 h，過濾，得到葉綠素提取液。

1.2 儀器與設備

EMX plus-10/12 EPR儀 德國布魯克公司；Avance III型核磁共振波譜儀 布魯克（瑞士）公司。

1.3 方法

1.3.1 EPR分析

分別取3 mL的油酸、亞油酸、亞麻酸置于50 mL小燒杯中，使其暴露在空氣中，在室溫（20±2）℃下自然氧化，每隔30 min取200 μL樣品置于核磁管中，加入20 μL配好的DMPO溶液混勻，5 min后將核磁管置于達到設定溫度的EPR儀諧振腔內進行測試。添加外源物實驗中，外源物的質量分數為0.02%。

EPR儀測定條件：中心磁場為3 350.00 G；掃場寬度為100.00 G；掃場時間為20.0 s；微波功率為3.99 mW；調制幅度為1.000 G；轉換時間為10.00 ms；加熱溫度為373.15 K。

1.3.21H NMR分析

分別取5 mL的油酸、亞油酸、亞麻酸置于50 mL小燒杯中，使其暴露在空氣中，在室溫（20±2）℃下自然氧化5 h，取氧化前和氧化后的樣品各100 μL加入核磁管中，并用4 mL的CDCl3溶劑溶解，搖勻后測定1H NMR。

1H NMR測定條件參考李添寶等[28]的方法：每次測定都進行調諧、勻場；溫度297.3 K；500 MHz核磁共振儀的頻率500.13 MHz；氫譜譜寬10 330.578 Hz；掃描16 次；空掃2 次；每個核磁樣品管測定6 次；譜圖處理時以四甲基硅烷定位。

1.3.3 相關譜圖分析

EPR譜圖：以自由基的自旋朗德因子（g因子，也稱g值）為自由基譜圖中心點，通過Xenon軟件點擊譜圖中心點可以直接讀出g值，實驗中擬合到的自由基g值均為2.006。對樣品的自由基譜圖進行基線校正，校正后進行二次積分，使用Xenon軟件自帶的自旋定量功能，可得到該樣品的自旋總數和自由基濃度。通過Xenon軟件中的自旋擬合（Spin fit）功能對樣品的實驗譜圖進行計算機擬合，根據擬合得到的各自由基加合物的超精細耦合常數，確定自由基的種類，根據擬合譜圖中不同自由基的峰面積對其定量。

1H NMR譜圖使用Topspin軟件進行處理，譜圖經校正零點后標峰，并讀出峰面積。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均重復3 次以上，結果用平均值±標準差表示。采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不飽和脂肪酸室溫氧化過程自由基變化分析結果

2.1.1 油酸室溫氧化過程自由基變化分析結果

油酸的EPR譜圖經擬合得到4 種自由基加合物：烷基自由基加合物（alkyl radical adducts，ARA）、烷氧自由基加合物（alkoxyl radical adducts，AORA）、烷過氧自由基加合物（alkyl peroxyl radical adducts，APRA）以及DMPO-X，DMPO-X通常被認為是DMPO氧化后產生的自由基，具體見圖1。

圖1 室溫光照過程的油酸氧化后EPR譜與其擬合譜Fig.1 Experimental and fitted EPR spectra of oleic acid oxidized under ambient light at room temperature

室溫光照下油酸氧化主要生成4 種自由基，分別是R·、RO·、ROO·以及DMPO-X，其各自的超精細耦合常數如表1所示。

表1 DMPO捕獲的自由基EPR參數Table 1 EPR parameters for radical adducts to 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide

油酸室溫氧化過程各自由基變化情況如圖2所示，室溫光照油酸氧化過程中各自由基的數量發生波動變化。氧化的前60 min R·數量較多，多于其他3 種自由基，隨氧化進行逐漸下降，210 min后R·一直保持相對最低的數量。RO·、ROO·和DMPO-X在氧化的前60 min數量大致相同，隨后呈現波動上升的變化趨勢，ROO·在90～300 min時數量是4 種自由基中最高的，氧化180 min之后，RO·的數量僅次于ROO·。

圖2 室溫光照油酸氧化過程中各自由基自旋數的變化Fig.2 Changes in the number of spins of free radicals in oleic acid during oxidation under ambient light at room temperature

2.1.2 亞油酸室溫氧化過程自由基變化分析結果

室溫氧化過程中亞油酸所含自由基種類與油酸類似，主要是R·、ROO·、DMPO-X和RO·，其各自超精細耦合常數見表1，各自由基變化情況如圖3所示。亞油酸中所含自由基主要是R·，ROO·數量次之，DMPO-X和RO·數量最少。與油酸相比，亞油酸中的各自由基數量在整個氧化過程中都是在一個比較低的范圍內波動。

圖3 室溫光照亞油酸氧化過程中各自由基自旋數的變化Fig.3 Changes in the number of spins of free radicals in linoleic acid during oxidation under ambient light at room temperature

2.1.3 亞麻酸室溫氧化過程自由基變化分析結果

亞麻酸中的自由基主要由R·構成，其超精細耦合常數見表1，RO·、ROO·由于數量過低與基線相差較小，難以擬合。如圖4所示，亞麻酸室溫氧化過程中，R·數量波動上升。

圖4 室溫光照亞麻酸氧化過程中R·自旋數的變化Fig.4 Changes in the number of spins of alkyl radicals in linolenic acid during oxidation under ambient light at room temperature

對比3 種脂肪酸的EPR結果可知，脂肪酸不飽和程度越高，越易發生自動氧化，其中R·的數量越高。在油脂的自動氧化過程中，R·主要存在于自動氧化的鏈傳遞階段，在這一階段不飽和脂肪酸中雙鍵旁亞甲基上的氫被奪取，形成大量的R·。因此，脂肪酸中的不飽和碳碳雙鍵越多，氧化時生成的R·自由基就越多。

2.2 不飽和脂肪酸氧化前后的核磁共振氫譜變化分析結果

1H NMR是表征脂質初級和二級氧化產物分子結構最常用的方法，其對于全面認識氧化過程和氧化機理有很大幫助。通過在氧化過程中監測脂質分子反應位點的質子峰，1H NMR可評估脂質的氧化狀態[29-30]。不飽和脂肪酸氧化過程伴隨一系列不同化學環境的氫原子的變化，1H NMR能夠提供油脂中化合物的氫原子信息，有助于認識不飽和脂肪酸的氧化。亞麻酸、亞油酸、油酸氧化5 h前后的1H NMR譜如圖5所示。

圖5 室溫光照不飽和脂肪酸氧化5 h前后的1H NMR譜Fig.5 1H NMR spectra of unsaturated fatty acids before oxidation and after oxidation for 5 h under ambient light at room temperature

1H NMR譜中，δ＝0.85處峰歸屬為亞油酸和油酸末端—CH3上的氫，δ＝0.96處峰歸屬為亞麻酸末端—CH3上的H，δ＝1.3處峰歸屬為—CH2上的H（脂肪族亞甲基氫），δ＝1.60處峰歸屬為與—C＝O相隔一個—CH2上的H，δ＝2.0處峰歸屬為與—C＝C—雙鍵相鄰—CH2上的H（烯丙基氫），δ＝2.3處峰歸屬為和—C＝O直接相連—CH2上的H，δ＝2.8處峰歸屬為位于兩個—C＝C—雙鍵之間—CH2上的H（雙烯丙基氫），δ＝5.3處峰歸屬為—C＝C—雙鍵上的H，δ＝11處峰歸屬為羧羥基上的H[28]。δ＝7.26處峰屬于溶劑CDCl3。由圖5A、B可知，氧化前后亞麻酸中的H原子種類沒有發生明顯變化，僅數量略有變化。對比氧化前后1H NMR譜圖上各峰的面積積分結果可以看出，氧化后的亞麻酸中雙烯丙基氫質子和烯丙基氫質子的數量降低，表明亞麻酸（RH）被引發生成R·和H·；而雙鍵上的氫以及亞麻酸末端甲基上的氫數量均降低，表明H·與更為活躍的ROO·結合生成亞麻酸氫過氧化物（ROOH）后，部分亞麻酸氫過氧化物分解生成了其他小分子物質，如醛、醇、烷烴等。對比圖5C、D可以看出，亞油酸氧化后，雙烯丙基氫質子和烯丙基氫質子數量略微降低，雙鍵氫數量也略微降低；對比圖5E、F可知，油酸中烯丙基氫、雙鍵氫以及脂肪族亞甲基氫數量略微降低；由此得出，亞油酸和油酸室溫氧化5 h可得到與亞麻酸一樣的結論，但亞油酸和油酸的氧化和降解程度較低于亞麻酸。

2.3 外源性物質對不飽和脂肪酸室溫氧化過程自由基的影響

2.3.1 不同外源物對不飽和脂肪酸室溫氧化時自旋總數的影響

室溫氧化條件下油酸、亞油酸、亞麻酸中加入TBHQ、VE、ADVN、葉綠素后以及以光照組為對照組的自旋總數變化如圖6所示。

圖6 含不同外源物的不飽和脂肪酸中自旋總數隨時間的變化Fig.6 Changes in the number of spins in unsaturated fatty acids with different exogenous substances over time

由圖6A可以看出，加入VE的油酸中自旋總數較低，而其他4 個樣品的初始自旋總數相差不大。在氧化的0～120 min及240～300 min階段，添加VE的油酸其EPR信號很弱，通過EPR譜圖僅可觀察到R·的存在（EPR譜未列出），且其數量一直處于很低的水平，說明VE抑制油酸室溫氧化的能力較強。而在氧化中間階段（120～240 min），3 個時間點的實驗圖譜非典型脂類自由基的EPR圖譜無法擬合，推測可能是在這段時間存在較多的VE提供H原子后產生的α-生育酚自由基導致譜圖重疊太過嚴重而難以分析。而添加TBHQ的油酸在氧化0～60 min期間自旋總數偏高，之后自旋總數降低，在180～300 min期間維持在一個較低的水平。而加入ADVN的油酸則一直在一個相對較高的水平上波動。添加葉綠素的油酸在測試期間其自旋總數一直在一個較大的范圍內波動，其原因可能是葉綠素激發了樣品中自由基的生成。由圖6B可知，加入TBHQ和VE的亞油酸初始自旋總數都較低，而且一直在較低的范圍內波動，加入葉綠素和ADVN的亞油酸初始自旋總數相對較高，而對照組的初始自旋總數最高。可能的原因是亞油酸比油酸多一個不飽和鍵，更易氧化，在非常短的時間內樣品被激發產生了自由基。然而在樣品氧化的前30 min中，對照組的自旋總數下降幅度比較大，而其他幾組的自旋總數只是小幅度下降。而在氧化210 min后，由于ADVN的加入引入了CCRA，導致這一組的自旋總數較大，添加VE和TBHQ的亞油酸其自旋總數最小。甚至加入TBHQ的亞油酸樣品由于譜圖信號太弱無法進行擬合，而加入VE的亞油酸樣品也僅能擬合到R·，即VE組樣品自旋總數的變化基本上都來自于R·。由圖6C可以看出，加入TBHQ和VE的亞麻酸的初始自旋總數都比較低，而且在整個氧化過程中其自旋總數也一直在一個較低的范圍內波動；加入葉綠素和ADVN的亞麻酸的初始自旋總數較高，且相對加入TBHQ和VE的亞麻酸，其波動范圍更大一些。

2.3.2 不同外源物對油酸室溫氧化時自由基的影響

由圖7A可知，加入TBHQ的油酸氧化過程中RO·、ROO·和DMPO-X都保持一個相對較低的數量，且變化幅度也較小。樣品中R·數量最高，其變化決定了樣品自旋總數的變化。而室溫光照油酸氧化過程（圖2）中數量最多的自由基是ROO·，其次是RO·，由此初步判斷TBHQ在加入油酸樣品之后抑制了RO·、ROO·的生成。結合TBHQ的抗氧化機理，可能原因是TBHQ在加入至樣品中后提供H·，其與RO·、ROO·結合形成ROOH以及其他更穩定的化合物，抑制了鏈式反應的進行，從而降低樣品中RO·、ROO·的數量。添加ADVN的油酸樣品中的自由基包括R·、ROO·、DMPO-X、RO·以及CCRA，其各自的超精細耦合常數見表1。由圖7B可以看出，在氧化前150 min，加入ADVN的油酸樣品中主要存在的自由基是R·，且R·氧化期間一直保持相對較高的數量。而其他4 種自由基在前150 min都數量較低，且RO·、ROO·和DMPO-X的數量一直保持較低的水平，而CCRA在150 min后數量急劇升高并超過R·，這類自由基可能是由于ADVN的加入而引發產生的。

圖7 油酸室溫氧化添加不同外源物質后各自由基自旋數隨時間的變化Fig.7 Changes in the number of spins of individual free radicals in oleic acid with different exogenous substances during oxidation at room temperature

2.3.3 不同外源物對亞油酸室溫氧化時自由基的影響

添加VE和ADVN后亞油酸室溫氧化過程的自由基變化見圖8，添加VE的亞油酸譜圖整體信號偏弱，僅能擬合到R·，經擬合得到的R·自旋數在很低水平上波動。添加ADVN的亞油酸譜圖中僅可擬合到R·和CCRA，其各自的超精細耦合常數見表1。與添加ADVN的油酸相比，其所含自由基缺少了RO·、ROO·。添加ADVN的亞油酸中R·和CCRA同油酸中的變化趨勢一致。由圖8還可以看出，CCRA在氧化0～210 min數量較低，210 min后數量激增，而R·一直保持在較低的水平上波動。加入葉綠素的亞油酸由于譜圖信號弱、雜質多，導致譜圖難以解析，但可以看出葉綠素組的自由基是以R·為主。

圖8 亞油酸室溫氧化時添加不同外源物質后各自由基自旋數隨時間的變化Fig.8 Changes in the number of spins of individual free radicals in linoleic acid with different exogenous substances during oxidation at room temperature

2.3.4 不同外源物對亞麻酸室溫氧化時自由基的影響

添加TBHQ、VE、ADVN、葉綠素后以及對照組的亞麻酸室溫氧化過程的自由基變化如圖9所示。光照下氧化的亞麻酸中僅擬合得到R·，在相同的檢測條件下，加入VE、葉綠素、TBHQ亞麻酸中的自由基組成與其類似，只有R·。由圖9A可知，對照組R·依舊保持波動增長的變化規律；VE組中的R·數量一直保持在一個相對較低的水平上，而TBHQ組由于自身引入了自由基，可能誘導了R·的生成，R·的數量在90 min增長到最大，隨后又下降并逐漸保持在比VE組略高的水平上。在亞麻酸中加入葉綠素，0～120 min期間誘導并促進了R·的生成，而在氧化120 min之后的階段，由于氧化的進行及活性物質的消耗，該組R·的數量顯著降低，但仍高于VE和TBHQ組。添加ADVN的亞麻酸中所含自由基除R·外還有CCRA，其自旋數的變化見圖9B。在油酸和亞油酸樣品中加入ADVN，其CCRA數量都是前期較低，后期迅速增加到較高的水平。而在亞麻酸樣品中，ADVN引發的CCRA數量一直保持在較低的水平，擬合結果以R·占絕大多數，可能是由于亞麻酸自身極易氧化，從而形成了大量R·。

圖9 亞麻酸室溫氧化時添加不同外源物質后各自由基自旋數隨時間的變化Fig.9 Changes in the number of spins of individual free radicals in linolenic acid with different exogenous substances during oxidation at room temperature

3 結 論

室溫光照下油酸和亞油酸的自動氧化主要生成4 種自由基，分別為R·、RO·、ROO·和DMPO-X，且其自由基總數一直處于一定的波動狀態。而在相同的檢測條件下，亞麻酸中的自由基主要是由R·構成的，其自旋總數同樣處于波動狀態。這表明在相同測試條件下，越易氧化的脂肪酸中R·的比例越高。脂肪酸室溫氧化時，VE和TBHQ的加入會提供H·，其與自由基結合從而抑制鏈式反應的進行，尤其會抑制RO·、ROO·的形成，而且VE對R·生成也具有顯著抑制作用，導致樣品EPR信號太低，難以擬合或僅能觀察到R·的形成，VE和TBHQ可有效延緩不飽和脂肪酸自氧化的進程。在不飽和脂肪酸中加入ADVN時，自由基以R·為主，同時會引入CCRA，ADVN可加劇不飽和脂肪酸自動氧化的鏈引發階段。加入葉綠素的脂肪酸樣品整體自由基水平也比較高，葉綠素會加速不飽和脂肪酸的氧化進程。