三甲散加減對晚期喉癌患者病灶組織增殖、凋亡和侵襲相關蛋白表達的影響

栗曉東 高仲軍 何敬 翟浩 田亮

在頭頸部惡性腫瘤中，喉癌發病率約占20%，且其發病率呈逐年上升趨勢[1]。目前，喉癌發病機制尚不清楚，但普遍認為腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲是涉及多個基因和多條信號通路的復雜調控過程[2,3]。三甲散加減由三棱、穿山甲、鱉甲、莪術等制成的中藥制劑，具有抗炎、抗腫瘤、調節免疫等作用[4,5]。本研究對晚期喉癌患者在同步放化療基礎上加用三甲散加減治療，觀察其對病灶組織增殖、凋亡和侵襲相關蛋白表達的影響，并以Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信號通路為靶點探討其作用機制，旨在為晚期喉癌的治療提供理論和實踐依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年10月至2020年10月張家口市第一醫院和蔚縣人民醫院收治的晚期喉癌患者70例為研究對象，隨機分為對照組和聯合組，每組35例。對照組男20例，女15例；年齡38～72歲，平均年齡(56.66±9.45)歲；聯合組男22例，女13例；年齡41～75歲，平均年齡(58.40±9.31)歲。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:①符合晚期喉癌診斷標準，并經病理檢查確診；②未接受過放化療或其他治療；③預計生存時間>3個月；④患者及家屬簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準:①重要臟器功能障礙者；②臨床資料不完整；③對本研究藥物過敏者；④合并其他惡性腫瘤者；⑤意識障礙、精神疾病患者。

1.3 治療方法 (1)對照組采用TPF方案(多西他賽注射液75 mg/m2,第1天靜脈滴注；順鉑40 mg/m2，第1～3天靜脈滴注；5-Fu 750 mg/m2，第1～5天靜脈滴注)。化療2個周期后行放療。采用 6 MV 直線加速器X線照射頸后區，劑量為2.0 Gy/d，5次/周。(2)聯合組在對照組基礎上給予三甲散加減治療。組方：三棱10 g、穿山甲15 g、鱉甲15 g、莪術10 g、海藻10 g、昆布10 g、落得打10 g、桃仁5 g、蟬衣5 g、紅花5 g，1劑/d，水煎成400 ml藥液，1劑/d，分早晚2次服用，連續治療8周。

1.4 觀察指標 采用Western blot測定喉癌組織增殖相關蛋白(STAT3、CyclinD1、c-myc)、凋亡相關蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)、EMT相關蛋白(N-cadherin、Vimentin、E-cadherin)、侵襲相關蛋白(CD44v6、COX-2、MMP-9)、Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白表達。

2 結果

2.1 2組增殖相關蛋白表達比較 2組治療前STAT3、CyclinD1、c-myc蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后STAT3、CyclinD1、c-myc蛋白表達均較治療前顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且聯合組治療后STAT3、CyclinD1、c-myc蛋白表達低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組增殖相關蛋白表達比較

2.2 2組凋亡相關蛋白表達比較 2組治療前Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后Bcl-2蛋白表達均較治療前顯著降低，Bax、Caspase-3蛋白表達均較治療前顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且聯合組治療后Bcl-2蛋白表達低于對照組，Bax、Caspase-3蛋白表達高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組凋亡相關蛋白表達比較

2.3 2組EMT相關蛋白表達比較 2組治療前N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后N-cadherin、Vimentin蛋白表達均較治療前顯著降低，E-cadherin蛋白表達均較治療前顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且聯合組治療后N-cadherin、Vimentin蛋白表達低于對照組，E-cadherin蛋白表達高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組EMT相關蛋白表達比較

2.4 2組侵襲相關蛋白表達比較 2組治療前CD44v6、COX-2、MMP-9蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后CD44v6、COX-2、MMP-9蛋白表達均較治療前顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且聯合組治療后CD44v6、COX-2、MMP-9蛋白表達低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組侵襲相關蛋白表達比較

2.5 2組Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達比較 2組治療前Wnt、β-catenin蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后Wnt、β-catenin蛋白表達均較治療前顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且聯合組治療后Wnt、β-catenin蛋白表達低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 2組Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達比較

2.6 2組PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白表達比較 2組治療前PI3K、p-Akt蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后PI3K、p-Akt蛋白表達均較治療前顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且聯合組治療后PI3K、p-Akt蛋白表達低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 2組PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白表達比較

3 討論

增殖異常和凋亡受限是腫瘤細胞的基本特征，也是惡性腫瘤發生發展的關鍵原因。STAT3是STAT家族的重要成員，持續激活的STAT3進入細胞核后通過調控靶基因的轉錄和表達發揮不同的生物學效應[6,7]。資料顯示，活化的STAT3能夠上調細胞周期相關蛋白(CyclinD1、CyclinB、c-myc等)表達，從而加速細胞周期進程及細胞惡性轉化，而阻斷STAT3活化能夠下調CyclinD1表達并上調促凋亡蛋白Bcl-2表達[8]。Caspase-3是Caspase-3家族成員，其過度活化能夠促進細胞凋亡[9]。Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡過程中發揮重要作用，其中促凋亡蛋白Bax通過增加線粒體膜通透性和細胞色素C釋放促進細胞凋亡；抗凋亡蛋白Bcl-2能夠抑制Caspase-3激活，從而抑制細胞凋亡[10,11]。本研究結果顯示，2組治療前STAT3、CyclinD1、c-myc、Bcl、Bax、Caspase-3蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后STAT3、CyclinD1、c-myc、Bcl-2蛋白表達均較治療前顯著降低，Bax、Caspase-3蛋白表達均較治療前顯著升高(P<0.05)，且聯合組治療后STAT3、CyclinD1、c-myc、Bcl-2蛋白表達低于對照組，Bax、Caspase-3蛋白表達高于對照組(P<0.05)。說明在常規放化療基礎上聯用三甲散加減治療晚期喉癌能夠調控增殖、凋亡相關蛋白表達，從而抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡。

研究發現，EMT是腫瘤細胞獲得侵襲能力并轉移至遠處臟器的主要原因[12,13]。EMT相關分子標志物包括E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等，EMT發生時E-cadherin表達降低，而N-cadherin、Vimentin表達增高[14]。CD44v6是一種細胞表面黏附分子，通過促進腫瘤細胞與基底膜結合參與腫瘤侵襲和轉移；COX-2是與腫瘤細胞增殖和侵襲密切相關的細胞因子，其表達增高可導致腫瘤耐藥，可作為評估預后的重要指標[15]；MMP-9是MMPs家族成員，通過降解細胞外基質和基底膜成分為腫瘤侵襲和轉移提供條件[16]。本研究結果說明在常規放化療基礎上聯用三甲散加減治療晚期喉癌能夠調控EMT進程，從而抑制腫瘤細胞侵襲和轉移。

研究證實，Wnt/β-catenin信號通路的持續活化可導致腫瘤細胞過度增殖，并抑制其凋亡，在細胞癌變過程中發揮重要作用。研究證實，Wnt/β-catenin信號通路與宮頸癌、胃癌、肺癌、喉癌等多種惡性腫瘤發生發展密切相關[17,18]。另外，PI3K/Akt信號通路是體內調控細胞分化和代謝的重要通路。既往研究證實，卵巢癌、甲狀腺癌、鼻咽癌等惡性腫瘤組織存在PI3K/Akt信號通路的異常激活，可通過調控Bcl-2、VEGF等蛋白表達參與腫瘤細胞增殖、凋亡和侵襲轉移過程[19,20]。但是，三甲散加減能夠通過調控Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信號通路影響喉癌細胞增殖、凋亡和侵襲，目前尚未見報道。本研究結果說明三甲散加減聯合同步放化療治療晚期喉癌能夠抑制Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信號通路的持續活化，從而抑制腫瘤細胞增殖、侵襲，并促進其凋亡。

綜上所述，在常規放化療基礎上聯用三甲散加減治療晚期喉癌通過調控相關蛋白表達抑制腫瘤細胞增殖、侵襲，并促進其凋亡，機制與抑制Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信號通路活化有關。