血清TBULC水平對肺腺癌的診斷價值

車開麗，姜 坤

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院檢驗科，江蘇淮安 223001

肺腺癌(LUAD)是肺癌最常見的亞型之一[1]。目前，LUAD血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物主要包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原-125和胃泌素釋放前體等，這些指標(biāo)的靈敏度和特異度均較低，診斷價值有限，可能造成漏診[2]。由于缺乏LUAD早期診斷的標(biāo)志物，無法對患者進行個體化的治療方案制訂、治療效果評估及復(fù)發(fā)預(yù)測，因此，為了提高LUAD患者的總體生存率，需要尋找具有高特異度和靈敏度的早期診斷標(biāo)志物。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度>200個核苷酸的非編碼RNA[3]，許多研究報道LncRNA在LUAD的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的作用[4-6]。ZHENG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的長鏈非編碼RNA(TBULC)在LUAD組織中的表達較癌旁組織明顯上調(diào)，并且與患者腫瘤大小相關(guān)，參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移。目前尚未見血清TBULC的表達與LUAD關(guān)系的相關(guān)報道，因此本研究采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測血清TBULC在LUAD患者、肺良性結(jié)節(jié)患者及健康體檢者血清中的表達情況，并探討血清TBULC對LUAD的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年9月至2020年4月于本院就診的116例LUAD患者作為LUAD組，其中男59例，女57例；年齡23～80歲，平均(59.53±9.92)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理組織標(biāo)本經(jīng)本院病理科確診為LUAD；(2)術(shù)前未進行放療、化療、靶向治療或中藥治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并嚴重心、肝、肺、腎等臟器功能障礙；(3)存在其他慢性疾?。?4)臨床病理資料不完整。另外選取肺良性結(jié)節(jié)患者110例作為肺良性結(jié)節(jié)組，其中男56例，女54例；年齡25～78歲，平均(58.25±10.02)歲。選取同期110例健康體檢者作為對照組，其中男57例，女53例；年齡26～79歲，平均(59.36±10.26)歲。3組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集與處理 采集各組研究對象空腹靜脈血3 mL于含有促凝劑的真空采血管中，5 000×g離心5 min，分離血清，4 ℃ 15 000×g離心5 min去除細胞碎片，置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2.2RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用RNA提取試劑盒(日本Takara公司)提取血清總RNA，經(jīng)核酸檢測儀(美國賽默飛世爾公司)檢測RNA濃度與純度，選擇吸光度(A)260 nm/A280 nm為1.8～2.0的RNA標(biāo)本，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3引物設(shè)計與合成 TBULC和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TBULC上游引物：5′-GGGGTG AGAGGAACAACAAA-3′，下游引物：5′-TGTCA GGGGAGCCATACAC-3′；GAPDH上游引物：5′-CCT GGTATGACAACGAATTTG-3′，下游引物：5′-CAG TGAGGGTCTCTCTCTTCC-3′。

1.2.4RT-qPCR檢測 采用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的T100 梯度PCR儀，按照日本Takara公司生產(chǎn)的SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書進行反應(yīng)體系配制。采用相對定量PCR的方法計算TBULC的相對表達水平。PCR反應(yīng)體系共25 μL，其中10 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL，熒光混合物10 μL，50×ROX染料0.5 μL，cDNA模板1 μL，雙蒸水11.5 μL。上述操作均在冰上進行，加樣完成后離心、上機。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火，延伸30 s，共40個循環(huán)。采用公式2-ΔΔCt計算相對表達水平。試驗重復(fù)5次。

1.2.5血清CEA水平檢測 采用羅氏公司生產(chǎn)的Cobas 801電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑檢測各組血清CEA水平。

2 結(jié) 果

2.13組血清TBULC、CEA水平比較 LUAD組血清TBULC、CEA水平均明顯高于肺良性結(jié)節(jié)組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肺良性結(jié)節(jié)組和對照組血清TBULC、CEA水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組血清TBULC、CEA水平比較

2.2LUAD患者手術(shù)前后血清TBULC水平比較 LUAD患者術(shù)前血清TBULC水平為3.558±0.559，術(shù)后為1.951±0.818，術(shù)前血清TBULC水平明顯高于術(shù)后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=41.463，P<0.05)。

2.3血清TBULC和CEA水平與LUAD患者臨床病理特征的關(guān)系 腫瘤最大徑≥3 cm 的患者TBULC和CEA水平高于<3 cm的患者，TNM Ⅲ～Ⅳ期的患者TBULC和CEA水平高于Ⅰ～Ⅱ期的患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者TBULC和CEA水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LUAD患者血清TBULC和CEA水平與性別、年齡均無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 LUAD患者血清TBULC和CEA水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4LUAD患者血清TBULC水平與CEA水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，LUAD患者血清TBULC水平與CEA水平呈正相關(guān)性(r=0.642，P<0.001)。

2.5血清TBULC與CEA對LUAD的診斷效能分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，TBULC的診斷閾值為2.84，在此閾值處，ROC曲線下面積(AUC)為0.878，靈敏度、特異度分別為98.10%和73.00%，均高于CEA。TBULC與CEA聯(lián)合檢測診斷LUAD的AUC、靈敏度、特異度均高于兩項指標(biāo)單獨檢測。見表3、圖1。

表3 血清TBULC與CEA對LUAD的診斷效能

3 討 論

LUAD作為常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率一直處于較高水平[8-10]，且由于發(fā)病隱匿，大部分患者在確診時已經(jīng)進入中晚期，導(dǎo)致其5年生存率較低[11-12]，因此，尋找高特異度和靈敏度的腫瘤標(biāo)志物一直是LUAD臨床研究的熱點。

本研究結(jié)果顯示，LUAD組血清TBULC水平明顯高于肺良性結(jié)節(jié)組和對照組(P<0.05)，肺良性結(jié)節(jié)組和對照組間血清TBULC水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示LUAD患者血清TBULC存在明顯高表達，出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能與TBULC參與了LUAD的發(fā)生過程有關(guān)。LUAD患者術(shù)前血清TBULC水平高于術(shù)后，提示TBULC可以作為患者手術(shù)治療效果的觀察指標(biāo)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤最大徑<3 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅠ～Ⅱ期的LUAD患者血清TBULC水平分別低于腫瘤最大徑≥3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TNM Ⅲ～Ⅳ期的患者，提示病情越嚴重的患者血清TBULC水平越高，考慮可能隨著病情加重，TBULC通過相應(yīng)的信號通路產(chǎn)生了更加明顯的生化調(diào)節(jié)，最終表現(xiàn)出更高的表達水平。ZHENG等[7]研究顯示，TBULC在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中高表達，并且在體外實驗中TBULC通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)途徑來促進NSCLC細胞的遷移和轉(zhuǎn)移，推測其可能也通過EMT途徑促進了LUAD的遷移和侵襲，但該結(jié)論需要進一步的研究驗證。在臨床工作中通過監(jiān)測TBULC的表達情況可以有效判斷LUAD患者的病情嚴重程度，進一步為臨床治療方案的制訂提供依據(jù)。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LUAD患者血清TBULC水平與CEA水平呈正相關(guān)，提示二者在LUAD發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在協(xié)同作用。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，TBULC與CEA聯(lián)合檢測診斷LUAD的效能高于TBULC、CEA單獨檢測，二者聯(lián)合檢測提高了診斷效能，有效減少了誤診和漏診。本研究缺少LUAD患者的隨訪資料，因此TBULC與LUAD患者預(yù)后之間的關(guān)系需要在今后的研究中進一步探討。

綜上所述，TBULC與LUAD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為LUAD治療效果及病情評估的良好指標(biāo)，且與CEA聯(lián)合檢測可提高對LUAD的診斷效能。