紅細胞免疫指標在老年股骨粗隆間骨折患者術后肺炎發生中的應用價值*

李韶華，杜慧杰，張進一，常建設，李瑞峰，銀曉永

冀中能源峰峰集團有限公司總醫院:1.檢驗科;2.藥劑科;3.呼吸科;4.心內科;5.胸外科;6.骨科,河北邯鄲 056000

股骨粗隆間骨折是骨質疏松癥嚴重的并發癥，好發于老年人群，骨折后應激反應引起的生理變化、骨折斷端失血及手術創傷嚴重影響患者的免疫狀態及自身穩態[1]，再加之多數老年患者合并基礎疾病，從而增加了肺炎的發病風險。BOHL等[2]的回顧性研究發現，髖部骨折術后30 d內患者肺炎發生率為4.1%，而并發肺炎的患者病死率明顯升高。因此，尋找早期診斷肺炎的有效指標，采取有效的治療措施，對降低肺炎病死率具有重要價值。目前，臨床常用的肺炎診斷指標包括白細胞計數(WBC)、紅細胞沉降率(ESR)、C-反應蛋白(CRP)、降鈣素原等，然而發生股骨粗隆間骨折的老年患者在圍術期由于創傷、失血、免疫水平低下等原因使上述指標靈敏度、特異度下降。紅細胞保留了與各種炎癥分子結合和相互作用的能力，可調節免疫反應，如宿主血紅蛋白(Hb)可被細菌的胞外蛋白酶激活，釋放殺菌活性氧，同時Hb還可通過細胞因子增加巨噬細胞與細菌的結合[3]。基于上述機制，有學者提出可將紅細胞補體受體1(ECR1)用于圍術期患者免疫水平監測、院內感染性疾病診斷等方面[4-5]。本研究探討了紅細胞免疫指標在老年股骨粗隆間骨折患者術后肺炎發生中的應用價值，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年6月至2020年6月本院骨科收治的老年股骨粗隆間骨折患者770例為研究對象，回顧性分析患者的臨床資料，將術后發生肺炎的46例患者納入肺炎組，未發生其他任何感染的724例患者納入對照組。納入標準：(1)年齡>60歲；(2)首次發生股骨粗隆間骨折；(3)接受人工髖關節置換術或內固定術治療；(4)臨床資料完整；(5)手術治療順利。排除標準：(1)術前已合并肺炎、其他感染性疾病或急性疾病；(2)術前合并腫瘤等其他嚴重消耗性疾病；(3)近半年內接受過免疫抑制劑治療。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 全自動FACS CantoTMⅡ流式細胞儀、ECR1(CD35)檢測試劑、ECR1(CD35)FITC熒光抗體、同型對照IgG1-FITC抗體均購自美國BD公司，分析軟件為BD FACSDivaTM；校準微球、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自德國歐蒙公司；紅細胞補體受體1花環率(ECR1-RR)試劑盒購自廊坊恒益生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1資料收集 從醫院電子病歷中收集患者的一般資料，包括性別、年齡、體質量指數(BMI)、吸煙史、手術時間、術中輸血、術中使用呼吸機、合并基礎疾病情況[糖尿病、高血壓、冠心病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等]、術前美國麻醉醫師協會(ASA)分級情況、術后第3天實驗室相關指標[WBC、CRP、ESR、Hb、紅細胞分布寬度(RDW)、ECR1-RR、紅細胞補體受體1幾何平均熒光強度(ECR1-GMFI)、清蛋白(ALB)]水平等。

1.3.2ECR1-RR檢測方法 術后第3天抽取患者靜脈血5 mL于肝素抗凝管中，2 000 r/min離心5 min，經生理鹽水洗滌、離心3次(每次輕輕吹散管底部沉積的紅細胞，2 000 r/min離心5 min，用吸管小心吸取上層生理鹽水棄去)，顯微鏡下計數紅細胞，然后配制成1.25×107/mL紅細胞懸液備用。根據郭峰法[6]檢測ECR1-RR，具體如下：將補體致敏酵母多糖凍干試劑溶解后制成使用液。紅細胞懸液用生理鹽水洗滌、離心1次，按紅細胞計數法配成1×108/mL紅細胞使用液備用。取試管加入紅細胞使用液0.075 mL，再加入補體致敏酵母多糖使用液0.075 mL，放入37 ℃水浴箱，30 min后取出，加入0.25%戊二醛 50 μL輕輕混勻，涂片，晾干，甲醛固定，加入少許瑞氏液及瑞氏緩沖液(pH值為8.4)，生理鹽水沖洗。顯微鏡下計數。

1.3.3ECR1-GMFI檢測方法 術后第3天抽取患者靜脈血1.5 mL于枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管中，混勻。取流式細胞儀專用試管，加入上述抗凝血5 μL，再加入20 μL熒光抗體和100 μL PBS，混勻后室溫避光放置20 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加PBS 1 000 μL重懸，1 500 r/min離心5 min，重復4次，棄上清，加PBS 300 μL，混勻后上機檢測。用全自動FACS CantoTMⅡ流式細胞儀檢測ECR1-GMFI，嚴格按照儀器說明書進行操作。

2 結 果

2.1兩組患者臨床資料比較 兩組患者性別、年齡、ESR、WBC、ECR1-RR、ECR1-GMFI、ALB、CRP水平，吸煙、COPD、貧血、ASA分級≥Ⅲ級、術中使用呼吸機的患者所占比例，以及手術時間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組患者BMI、RDW水平，高血壓、糖尿病、冠心病、術中輸血患者所占比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

組別nWBC(x±s,×109/L)貧血[n(%)]RDW(x±s,%)ESR(x±s,mm/h)ECR1-RR(x±s,%)ECR1-GMFI(x±s)肺炎組4613.73±2.6325(54.35)13.12±4.5133.11±8.8218.45±2.1657.38±11.44對照組7247.11±2.33276(38.12)12.42±3.8125.22±4.3222.07±3.4772.92±11.17t/χ218.7014.7801.1307.844-12.690-9.137P<0.0010.0290.258<0.0010.034<0.001

組別nALB(x±s,g/L)CRP(x±s,mg/L)ASA分級≥Ⅲ級[n(%)]手術時間(x±s,min)術中使用呼吸機[n(%)]術中輸血[n(%)]肺炎組4634.72±5.1158.01±11.8020(43.48)75.75±20.3114(30.43)41(89.13)對照組72436.51±5.2245.18±20.74182(25.14)65.22±15.38133(18.37)619(85.50)t/χ2-3.5787.3867.5185.6564.0760.466P0.001<0.0010.006<0.0010.0440.495

2.2WBC、ECR1-RR、ECR1-GMFI水平與患者術后肺炎發生的相關性 WBC水平與ECR1-RR、ECR1-GMFI水平呈負相關(r=-0.136、-0.270，P<0.05)，ECR1-RR水平與ECR1-GMFI水平呈正相關(r=0.709，P=0.002)。進一步分析上述3項指標與患者術后肺炎發生的相關性，結果顯示，WBC水平與患者術后肺炎發生呈正相關(r=0.550，P<0.05)；ECR1-RR、ECR1-GMFI水平與患者術后肺炎發生呈負相關(r=-0.289、-0.313，P<0.05)。

2.3患者術后發生肺炎的危險因素分析 將結果2.1中差異有統計學意義的指標(ECR1-RR除外，因ECR1-RR、ECR1-GMFI均是反映ECR1數量的指標，在多因素Logistic回歸分析中，為避免二者因共線而互相干擾，僅采用ECR1-GMFI進行分析，并對其進行標準化處理)納入多因素Logistic回歸分析模型，結果顯示，年齡>80歲、吸煙、WBC>10×109/L、貧血、標準化的ECR1-GMFI水平降低、ASA分級≥Ⅲ級、手術時間≥60 min是患者術后發生肺炎的獨立危險因素(P<0.05)，在調整了性別、年齡>80歲、吸煙、COPD、貧血、ESR水平升高、低清蛋白血癥、CRP水平升高、ASA分級≥Ⅲ級、手術時間≥60 min、術中使用呼吸機等因素后，WBC>10×109/L、標準化的ECR1-GMFI水平降低仍然是患者術后發生肺炎的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析結果

2.4ECR1-GMFI、WBC單獨及聯合檢測對患者術后發生肺炎的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示，ECR1-GMFI聯合WBC診斷患者術后發生肺炎的曲線下面積(AUC)為0.984，靈敏度為96.32%，特異度為91.57%，高于2項指標單獨檢測。見表3。

表3 ECR1-GMFI、WBC單獨及聯合檢測對患者術后發生肺炎的診斷價值

3 討 論

每個紅細胞上的補體受體1(CR1)為50～1 400個，明顯少于B細胞和吞噬細胞上的CR1數量，但人體內紅細胞數是白細胞數的1 500倍左右[7]，因此，體內90%的CR1存于紅細胞膜上。紅細胞主要通過ECR1參與抗原及循環免疫復合物的免疫黏附、抗原提呈、氧化殺菌，因此，ECR1作為跨紅細胞膜的捕獲抗原及循環免疫復合物的介質發揮著重要作用[8]。國內關于紅細胞免疫指標的臨床研究中，多采用郭峰法檢測ECR1-RR，即人工統計形成花環的紅細胞數，計算花環率，進而得出紅細胞免疫水平[4-5,8-10]。喻德富[11]研究發現，髖部骨折患者的ECR1-RR水平顯明顯低于健康對照人群，進行人工全髖關節置換術后患者ECR1-RR水平進一步降低，這是因為在嚴重外傷與手術后，ECR1結合大量受傷部位釋放的免疫復合物，并提呈給免疫組織吞噬或分解，從而導致待結合的ECR1減少，清除循環免疫復合物的能力下降[12]。

羅慶峰等[10]采用流式細胞儀檢測ECR1數量，并發現其與紅細胞天然免疫黏附腫瘤細胞功能呈顯著正相關(r=0.609，P<0.05)，因此認為ECR1是紅細胞天然免疫黏附腫瘤細胞發揮功能的物質基礎。本研究相關性分析發現，ECR1-RR、ECR1-GMFI水平與患者術后肺炎發生呈負相關(r=-0.289、-0.313，P<0.05)，提示ECR1-RR、ECR1-GMFI作為反映紅細胞膜上待結合ECR1數量的指標，其水平降低與股骨粗隆間骨折患者術后發生肺炎有關。WBC作為感染性疾病診斷的敏感指標之一，其水平升高提示存在感染的可能，本研究中WBC水平與ECR1-RR、ECR1-GMFI水平呈負相關(r=-0.136、-0.270，P<0.05)，提示ECR1-RR、ECR1-GMFI與感染的發生也有一定關系。李慧等[13]研究發現，剖宮產術后感染組ECR1-RR水平明顯低于非感染組，且隨著感染組WBC水平升高，ECR1-RR水平逐漸下降。一般認為在感染發生部位白細胞在趨化因子的誘導下聚集并吞噬、溶解病原體及病變細胞，同時在發生感染時細菌被補體C3b、iC3b、C4b標記然后被紅細胞膜上的ECR1結合(即免疫黏附)，在血液中，這種免疫黏附使細菌、免疫復合物、經調理的細胞片段被紅細胞運輸到肝和脾的血竇，最終被血竇中的吞噬細胞吞噬、溶解[14]。BREKKE等[8]通過比較不同ECR1數量的全血標本清除細菌的能力發現，ECR1數量與血漿中游離細菌數量、粒細胞吞噬作用呈負相關。雖然在輕癥感染患者中CRP、ESR水平升高往往比臨床體征出現得更早，但在本研究中ESR、CRP水平升高都不是股骨粗隆間骨折患者術后發生肺炎的獨立危險因素，考慮出現該結果的原因可能為：手術造成的軟組織損傷、術區的壞死組織及局部淤血吸收，以及手術植入物的異物反應都會造成CRP、ESR水平升高，從而干擾了其對感染的監測能力，因此，上述2項指標不適合在大型手術后作為早期感染的監測指標。在調整了性別、年齡>80歲、吸煙、COPD、貧血、ESR水平升高、低清蛋白血癥、CRP水平升高、ASA分級≥Ⅲ級、手術時間≥60 min、術中使用呼吸機等因素后，WBC>10×109/L、標準化的ECR1-GMFI水平降低仍然是股骨粗隆間骨折患者術后發生肺炎的獨立危險因素(P<0.05)。進一步分析WBC與ECR1-GMFI對患者術后肺炎的診斷價值，結果顯示，WBC與ECR1-GMFI聯合檢測的診斷效能高于各項指標單獨檢測，提示臨床可將紅細胞免疫指標ECR1-GMFI與WBC聯合用于患者術后肺炎的早期診斷，以提高診斷效能。

綜上所述，ECR1-GMFI水平下降是老年股骨粗隆間骨折患者術后發生肺炎的獨立危險因素，且將其與WBC聯合還可提高對患者術后肺炎的診斷效能。此外，本研究為回顧性研究，雖然在一定程度上控制了混雜因素對結果的干擾，但是所得結論仍然需要更嚴格的大樣本隨機對照研究進一步驗證。