血清miR-182、SP-D水平與膿毒癥患者預后的關系*

吳梅秋，邱名耀，王海曼，黎曉虹

海南醫學院第一附屬醫院：1.創傷ICU；2.急診科，海南海口 570102

膿毒癥是嚴重感染、創傷、休克、大手術后常見的并發癥及患者死亡原因之一，是由各種致病微生物感染引起的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，可進一步導致多器官功能衰竭，其中肺是最易發生感染的器官[1-2]。近年來，膿毒癥發病率及病死率呈逐年上升趨勢，已對人類健康造成嚴重威脅。既往研究多以白細胞計數及其分類、C反應蛋白等指標來評估膿毒癥患者的預后，但上述指標特異度較低[3-4]。因此，積極探索與膿毒癥預后有關的分子生物學指標，制訂完善的預后評價系統，將有利于防止膿毒癥患者病情惡化并改善其預后。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的內源性非編碼核苷酸，在細胞生長、發育、分化中發揮重要的調節作用[5]。miRNA-182是miRNA家族的一員，定位于人7號染色體(7p32.2)，與腫瘤發生發展、炎性反應有關[6]。肺表面活性蛋白D(SP-D)屬于C型凝集素超家族成員，參與病原體的清除及免疫反應﹑炎性反應和過敏反應的調節，與肺部疾病有關[7]。目前，有關血清miR-182、SP-D在膿毒癥患者中的表達情況及與預后關系的研究較少，本研究對此進行了相關探討，以期為臨床診治工作提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年5月本院創傷ICU收治的膿毒癥患者120例作為膿毒癥組，其中男59例，女61例；年齡40～83歲，平均(62.18±10.52)歲。根據膿毒癥患者28 d時的預后情況又將其分為死亡組26例，存活組94例。另選取同期非膿毒癥引起的SIRS患者120例作為SIRS組，其中男60例，女60例；年齡40～83歲，平均(62.55±10.19)歲。選取同期健康體檢者120例作為對照組，其中男63例，女57例；年齡41～83歲，平均(62.27±10.26)歲。膿毒癥組、SIRS組與對照組性別、年齡等基線資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)膿毒癥組患者均符合膿毒癥相關診斷標準[8]，即存在感染、序貫器官衰竭評分(SOFA)[9]≥2分；(2)SIRS組患者符合SIRS相關診斷標準[10]，即體溫>38 ℃或<36 ℃，心率>90次/分，呼吸頻率>20次/分或二氧化碳分壓(PaCO2)<4.6 kPa，白細胞計數>12×109/L或<4×109/L；(3)臨床資料完整者。排除標準：(1)近期使用免疫抑制劑治療的患者；(2)不愿意配合本研究的患者。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準后實施，所有受試對象及其家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 SP-D酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號SEA480Hu-1)購自上海恒斐生物科技有限公司；Trizol試劑(貨號MN562J2)、反轉錄試劑盒(貨號J6547M)、SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒(貨號N5643MJ)購自美國Sigma公司；miR-182及內參U6引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；熒光定量PCR分析儀(型號QuantGene 9600)購自杭州博日科技有限公司。

1.3方法

1.3.1資料收集 收集膿毒癥組患者的臨床資料，包括性別、年齡、感染部位、降鈣素原(PCT)水平。采用急性生理與慢性健康狀況Ⅱ(APACHE Ⅱ)評分對膿毒癥組患者入院時疾病嚴重程度進行評分，以急性生理評分、年齡評分、慢性健康評分3項指標為評分依據，最高分為71分，分數越高，病情越嚴重[11]。

1.3.2標本采集 收集所有患者入院后24 h內及體檢者體檢當日空腹肘靜脈血5 mL，靜置25～30 min，室溫條件下以4 000 r/min離心10 min，取上清液，于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.3血清SP-D水平檢測 從-80 ℃冰箱中取出血清標本，解凍，采用ELISA檢測血清SP-D水平，操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4血清miR-182水平檢測 從-80 ℃冰箱中取出血清標本，按照試劑盒說明書提取總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。參照熒光定量PCR試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR反應，所用引物序列見表1。反應體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，cDNA 1 μL，H2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL。反應步驟：95 ℃預處理20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40個循環。以U6作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算血清miR-182相對表達水平。

表1 引物序列

2 結 果

2.1對照組、SIRS組、膿毒癥組血清miR-182、SP-D水平比較 與對照組比較，SIRS組、膿毒癥組血清miR-182、SP-D水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與SIRS組比較，膿毒癥組血清miR-182、SP-D水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組、SIRS組、膿毒癥組血清miR-182、SP-D水平比較

2.2存活組與死亡組臨床資料比較 存活組與死亡組性別、年齡、感染部位比較，差異無統計學意義(P>0.05)；死亡組APACHE Ⅱ評分、血清PCT水平均明顯高于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 存活組與死亡組臨床資料比較

2.3存活組與死亡組血清miR-182、SP-D水平比較 與存活組比較，死亡組血清miR-182、SP-D水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 存活組與死亡組血清miR-182、SP-D水平比較

2.4膿毒癥患者血清miR-182、SP-D、PCT水平與APACHE Ⅱ評分的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，膿毒癥患者血清miR-182、SP-D、PCT水平與APACHE Ⅱ評分均呈正相關(r=0.623、0.597、0.433，P<0.05)。見表5。

表5 血清miR-182、SP-D、PCT水平與APACHE Ⅱ評分的相關性

2.5血清miR-182、SP-D水平與膿毒癥患者28 d短期生存率的關系 根據miR-182、SP-D水平均值(3.96、172.53 ng/mL)將膿毒癥患者分為miR-182高表達組(58例)與miR-182低表達組(62例)，SP-D高表達組(60例)與SP-D低表達組(60例)。miR-182高表達組與SP-D高表達組的28 d累積生存率分別為65.52%(38/58)、70.00%(42/60)；miR-182低表達組與SP-D低表達組的28 d累積生存率分別為90.32%(56/62)、86.67%(52/60)。miR-182低表達組的28 d累積生存率明顯高于miR-182高表達組，差異有統計學意義(χ2=11.742，P=0.001)；SP-D低表達組的28 d累積生存率明顯高于SP-D高表達組，差異有統計學意義(χ2=5.447，P=0.020)。Kaplan-Meier生存曲線見圖1、2。

圖1 miR-182高、低表達組患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.6膿毒癥患者死亡的危險因素分析 以膿毒癥患者是否死亡為因變量，以血清miR-182、SP-D、APACHEⅡ評分、PCT水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，miR-182、SP-D、APACHEⅡ評分、PCT水平升高是膿毒癥患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)。見表6。

表6 膿毒癥患者死亡的危險因素分析

圖2 SP-D高、低表達組患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

膿毒癥作為一種SIRS，由感染引起，是ICU常見的危重癥，極易引發多器官功能衰竭，若不及時診斷、治療，其病死率可高達80%[12]。因此，積極探尋分子生物學指標，及早評估膿毒癥預后并及時采取相應措施，對降低膿毒癥患者的死亡風險，改善患者預后有重大意義。

miRNA是一類非編碼短鏈RNA，長度為18～25個核苷酸，可以調節細胞早期發育，參與組織細胞分化與成熟，調控基因表達[13]。研究證實，miRNA可通過影響多種靶基因的表達及生物合成來調控炎性反應的發生[14]。miR-182的表達水平受基因轉錄和miRNA加工等調控，與免疫炎性反應關系密切。既往研究顯示，膿毒癥大鼠血清miR-182水平明顯高于健康大鼠[15]。也有研究發現，與健康對照者比較，早期膿毒癥患者血清miR-182水平明顯升高，可作為早期膿毒癥的診斷標志物[16]。本研究結果顯示，膿毒癥組血清miR-182水平明顯高于對照組和SIRS組，死亡組血清miR-182水平明顯高于存活組，提示血清miR-182高表達可能與膿毒癥的發生、發展及預后關系密切，原因可能是膿毒癥發生、發展過程中存在著明顯的免疫功能紊亂，Toll樣受體(TLR)信號通路是發揮抗炎及修復作用的重要調節通路，涉及多種炎癥因子，而miR-182是TLR信號通路的調控因子，其與白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的產生有關[17]。SP-D屬于肺表面活性物質，能降低肺表面張力，維持肺泡腔內肺表面活性物質磷脂的正常結構及功能，促進免疫系統對病原菌的清除，進一步抑制炎癥因子的釋放及淋巴細胞的增生[18]。當肺部受到感染后，肺血管內皮細胞抗凝血酶-2的完整性受損，肺血管通透性增加，促使肺泡中的SP-D向血管內滲透，進入血液循環，使血清中SP-D水平升高[19]。因此，血清SP-D水平變化可用于判斷膿毒癥患者病情變化及指導臨床治療。周江等[20]研究發現，與健康對照組比較，膿毒癥組血清SP-D水平明顯升高，且SP-D水平對膿毒癥所致靶器官損傷的病情評估有一定指導意義。本研究結果顯示，膿毒癥組血清SP-D水平明顯高于SIRS組及對照組，死亡組血清SP-D水平明顯高于存活組，提示血清SP-D高表達可能與膿毒癥發生、發展及預后關系密切，原因可能是膿毒癥患者極易出現肺損傷，使肺血管通透性增加，促使肺泡中的SP-D向血管內滲透，進入血液循環，從而使血清SP-D水平異常升高。APACHEⅡ評分是根據患者年齡和既往健康狀況對生命體征進行的評分，能夠反映疾病嚴重程度[21]。PCT與細菌感染有關，對炎性反應有較高的敏感性及特異性[22]。本研究中，死亡組APACHE Ⅱ評分、PCT水平明顯高于存活組，提示APACHE Ⅱ評分及PCT水平與膿毒癥患者的預后有關。Pearson相關分析結果顯示，死亡組血清miR-182、SP-D、PCT水平與APACHE Ⅱ評分均呈正相關，提示miR-182、SP-D、PCT也可用于反映膿毒癥患者的病情嚴重程度。

對膿毒癥患者28 d短期預后進行評價，對死亡的高危患者進行甄別，并早期給予適當干預，能夠減緩或逆轉病情惡化、減少病死率。宋中海等[23]研究顯示，血清PCT、中性粒細胞CD64百分比等指標聯合應用可評價膿毒癥患者28 d病情轉歸情況，對于制訂最佳治療方案，改善患者預后有重要意義。本研究中，miR-182低表達組28 d累積生存率明顯高于miR-182高表達組，SP-D低表達組28 d累積生存率明顯高于SP-D高表達組；且進一步分析發現，miR-182、SP-D、APACHEⅡ評分、PCT水平升高均是膿毒癥患者死亡的獨立危險因素。說明監測血清miR-182、SP-D、PCT水平并及時進行APACHEⅡ評分對臨床評估膿毒癥患者的預后有重要意義，APACHEⅡ評分、miR-182、SP-D、PCT水平升高的膿毒癥患者短期死亡風險較大，對該部分患者在治療中應予以重點關注。

綜上所述，膿毒癥患者血清miR-182、SP-D水平異常升高，是患者死亡的獨立危險因素，可為膿毒癥患者臨床預后評估提供一定參考。