OTUB2表達下調對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲能力及PI3K/AKT信號通路的影響*

任舒婷，魏曉巍，任傳路△

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇四醫院檢驗科，江蘇無錫 214044；2.南京醫科大學第二附屬醫院檢驗醫學中心，江蘇南京 210011

胃癌是全球最常見的腫瘤之一，由于早期癥狀不明顯，大多數胃癌患者在確診時已處于晚期或出現遠處轉移[1-3]。胃癌致病和轉移機制的復雜性和多因素性被認為是降低該病患者生存率的主要原因。目前，迫切需要能早期識別胃癌進展的關鍵分子標志物，以幫助臨床早期治療，改善患者預后。含OTU結構域的泛素醛結合蛋白2(OTUB2)是一種去泛素化酶，屬于卵巢腫瘤超家族蛋白，首次在果蠅卵巢腫瘤基因中被發現[4]。研究表明，OTUB2有廣泛的生物學作用,包括防止病毒誘導激活干擾素調節因子3 (IRF3)和核因子-κB(NF-κB)[5],促進人類胰腺胰島β細胞生存[6],并維持DNA修復途徑，促進乳腺癌和肺癌的進展和轉移[7-10]。然而關于OTUB2在胃癌發生、發展中的作用尚不清楚。本研究觀察了下調OTUB2對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲能力及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞來源 人胃癌細胞系MGC-803購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。

1.2儀器與試劑 ABI Prism 7000熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000轉染試劑和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，OTUB2小干擾RNA(si-OTUB2)及其對照si-NC購自上海吉瑪制藥技術有限公司，PrimeScript RT試劑盒和SYBR Premix ExTaq RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司，TaqMan試劑盒購自美國BioVision公司，OTUB2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，CCK-8試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司，增強化學發光(ECL)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司，基質膠購自美國Thermo公司，兔多克隆抗體OTUB2、增殖細胞核抗原(PCNA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、AKT、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和GAPDH購自美國Abcam公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養、轉染 所有細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37 ℃、5% CO2的濕化培養箱中培養。使用Lipofectamine 2000轉染試劑根據說明書向MGC-803細胞轉染si-OTUB2序列(si-OTUB2組)及陰性對照si-NC序列(si-NC組)，另設置空白對照組不做任何轉染處理。采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白質印跡法(Western blot)檢測OTUB2的轉染情況。

1.3.2RT-qPCR檢測細胞中OTUB2 mRNA表達水平 采用Trizol試劑并按照說明書要求提取細胞中的總RNA；采用PrimeScript RT試劑盒反轉錄合成cDNA；采用SYBR Premix ExTaq RT-PCR試劑盒擴增cDNA；采用ABI Prism 7000熒光定量PCR儀檢測mRNA水平。以GAPDH作為內參基因，使用2-ΔΔCt法計算OTUB2 mRNA的表達水平。引物序列，OTUB2：上游引物5′-ACACTTGGAACCGGCTTGAC-3′，下游引物5′-AGCACACGGACTGTCCTGA-3′；GAPDH：上游引物5′-CAGCAAGAGCACAAGAGGAA-3′，下游引物5′-ATGGTACATGACAAGGTGCGG-3′。實驗重復3次。

1.3.3Western blot檢測細胞中OTUB2蛋白表達水平 轉染后從細胞中分離出總蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白表達水平。蛋白標本經12% SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉移到PVDF膜上，在脫脂乳中封閉后加入1∶1 000稀釋的一抗OTUB2和GAPDH，并在4 ℃孵育過夜，隨后用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗在室溫下孵育2 h。利用ECL檢測系統觀察蛋白質。以OTUB2蛋白條帶與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示OTUB2蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖情況 按照CCK-8試劑盒說明書，將4 000個處于對數生長期的MGC-803細胞接種到96孔板中，培養96 h。每隔24 h加入CCK-8試劑，然后孵育2 h。使用分光光度計檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，用于反映細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.3.5Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力 細胞遷移實驗：將具有8 mm孔徑的Transwell小室放入24孔板中檢測細胞的遷移能力。將200 μL細胞懸浮液(1 000個細胞)懸浮于不含胎牛血清的DMEM培養基中，然后加入上室中。 隨后將500 μL含有10%胎牛血清的DMEM培養基加入下室中。24 h后，用磷酸鹽緩沖液沖洗并用結晶紫染色，計算遷移細胞數量。細胞侵襲實驗：實驗前將60 μL基底膠(50 μg/mL)加到上室板表面，孵育2 h,其余步驟同細胞遷移實驗。實驗重復3 次。

1.3.6Western blot檢測細胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、AKT和p-AKT蛋白表達水平 檢測步驟同1.3.3，不同的是在脫脂乳中封閉后，加入1∶1 000稀釋的一抗PCNA、E-cadherin、N-cadherin、AKT、p-AKT和GAPDH。實驗重復3次。

2 結 果

2.1轉染si-OTUB2的胃癌細胞中OTUB2的表達情況 與空白對照組和si-NC組比較，si-OTUB2組OTUB2 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖1和表1。

注：1為空白對照組；2為si-NC組；3為si-OTUB2組。圖1 Western blot檢測3組細胞中OTUB2蛋白的表達情況

表1 3組細胞中OTUB2 mRNA、蛋白表達水平比較

2.2轉染si-OTUB2的胃癌細胞增殖能力的變化 與空白對照組和si-NC組比較，si-OTUB2組細胞增殖能力減弱(P<0.05)。見圖2。

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與si-NC組比較，#P<0.05。圖2 3組細胞的生長曲線

2.3轉染si-OTUB2的胃癌MGC-803細胞遷移和侵襲能力的變化 與空白對照組和si-NC組比較，si-OTUB2組細胞遷移數和侵襲數均減少(P<0.05)。見圖3和表2。

圖3 3組細胞遷移和侵襲情況

表2 3組細胞遷移數和侵襲數比較個)

2.4轉染si-OTUB2的胃癌細胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、AKT和p-AKT蛋白表達情況 與空白對照組和si-NC組比較，si-OTUB2組細胞中PCNA、N-cadherin和p-AKT蛋白表達水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖4和表3。

注：1為空白對照組；2為si-NC組；3為si-OTUB2組。圖4 3組細胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、p-AKT和AKT蛋白的表達情況

表3 3組細胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、p-AKT和AKT蛋白表達水平比較

3 討 論

OTUB2在調控DNA修復通路、病毒觸發信號、胰腺細胞活性和腫瘤進展等方面發揮著重要作用。其中，OTUB2決定DNA修復途徑的選擇，在DNA雙鏈斷裂反應的早期調節環指蛋白8(RNF8)介導的致死因子惡性腦瘤樣蛋白1抗體(L3MBTL1)泛素化[7]。LI等[5]研究發現，OTUB2可通過直接介導腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)3和TRAF6(TRAF3和TRAF6是NF-κB所需的兩種E3泛素連接酶)的去泛素化來抑制病毒引發的Ⅰ型干擾素誘導。此外，OTUB2在腫瘤進展中也發揮了重要作用。MA等[11]的研究表明，OTUB2可以通過NF-κB信號通路促進甲狀腺癌細胞的增殖和侵襲。ZHANG等[9]發現，OTUB2通過激活不依賴于Hippo的Yes相關蛋白(YAP)和具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子(TAZ)，促進乳腺癌的體內轉移。LI等[10]的研究顯示，OTUB2通過AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路穩定U2小核RNA輔助因子2(U2AF2)，促進非小細胞肺癌的瓦爾堡效應，促進腫瘤發生和轉移。本研究發現，OTUB2在胃癌中發揮癌基因的作用，敲減OTUB2可以顯著抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

PCNA是一種重要的真核復制輔助因子，在DNA復制和修復、細胞周期調控和細胞凋亡等方面發揮著重要作用，與細胞增殖、DNA合成、腫瘤細胞的生長密切相關，是反映細胞增殖活性的重要指標[12-14]。E-cadherin和N-cadherin是參與上皮間質轉化(EMT)的相關蛋白，分別是上皮細胞標志物和間質細胞標志物[15]。腫瘤轉移是一個多步驟的細胞生物學過程，包括一個關鍵事件EMT，EMT通過促進上皮細胞去極性，減少上皮細胞標志物的表達，誘導間質細胞標志物的表達，從而促使良性腫瘤發展為惡性轉移性腫瘤[16]。本研究結果顯示，下調OTUB2的表達后，胃癌細胞中PCNA和N-cadherin蛋白的表達水平均明顯降低，E-cadherin蛋白的表達水平升高，進一步驗證了下調OTUB2可以抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的結論。

PI3K/AKT通路的改變廣泛存在于包括胃癌在內的多種腫瘤中，對腫瘤的發生和發展起著至關重要的作用，其中AKT在被PI3K磷酸化后激活，可促進腫瘤的進展[17-18]。此外，PI3K/AKT通路參與細胞增殖、凋亡、轉移和EMT等多種生物學過程[19-20]。本研究在胃癌細胞中敲減OTUB2基因，從而顯著抑制了PI3K/AKT信號通路中p-AKT的表達，說明下調OTUB2的表達可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路活化來抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，在胃癌細胞中，下調OTUB2的表達能顯著抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路有關。OTUB2有望成為胃癌的潛在預后評估指標和治療靶點。