SIRT3過表達抑制肝癌細胞的遷移與侵襲*

宋春麗，張 琰，周義文

南方醫科大學深圳醫院臨床檢驗醫學中心,廣東深圳 518100

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，其起病隱匿、進展迅速、惡性程度高、病死率高[1]。sirtuin蛋白家族是近年來發現的一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴的組蛋白去乙酰化酶，包括沉默信息調節因子(SIRT)1～SIRT7。其中，SIRT3是線粒體內主要的去乙?；福湓诒痪€粒體基質加工肽酶切割后活化，全長SIRT3駐留在細胞核中，在相關因素(例如DNA損傷)影響下，SIRT3會遷移到線粒體內。SIRT3目前已知的功能包括參與細胞凋亡、能量代謝、熱量限制、氧化應激等[2-6]。近年來，關于SIRT3在腫瘤發生、發展中的作用受到越來越多的關注。本研究在肝癌細胞株Huh-7中轉染pc-DNA3.1質粒(對照)及SIRT3質粒，用細胞劃痕實驗和細胞侵襲實驗來探索SIRT3基因過表達對肝癌細胞遷移能力和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料來源 人肝癌細胞株Huh-7來自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。

1.2儀器與試劑 蛋白質印跡法(Western blot)電泳儀、電轉膜儀、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)擴增儀均購自美國伯樂公司；高速低溫離心機購自德國艾本德股份有限公司；酶標儀購自美國Genecopoeia公司；DMEM培養基、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)、青鏈霉素雙抗購自美國賽默飛世爾公司；對照pc-DNA3.1質粒、構建在載體pc-DNA3.1上的SIRT3質粒購自美國Addgene公司；SIRT3引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；SYBR Green PCR反應混合液購自瑞士Roche公司；反轉錄PCR試劑盒購自美國伯樂公司；蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；SIRT3抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記二抗購自美國GE公司；Transwell小室購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養 人肝癌細胞株Huh-7培養于10%高糖DMEM培養基中(含10%胎牛血清)，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，待細胞長滿培養皿的80%后進行傳代，接種于6孔板中，每孔約8×104個細胞;于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，用對照pc-DNA3.1質粒轉染Huh-7細胞(對照組)，用SIRT3質粒轉染Huh-7細胞(實驗組)，24 h后換液，轉染72 h后兩組均進行RT-qPCR和Western blot檢測。

1.3.2RT-qPCR檢測SIRT3 mRNA表達水平 提取細胞總RNA，以隨機引物進行反轉錄合成cDNA，于-20 ℃下保存。取1.0 μL cDNA，SIRT3上、下游引物各0.2 μL及 5.0 μL SYBR Green PCR反應混合液，并補充去RNA酶水3.6 μL構建成10.0 μL反應體系，進行定量PCR擴增。擴增條件:95 ℃ 2 min(預變性)、94 ℃ 20 s(變性)、60 ℃ 20 s(退火)、72 ℃ 20 s(延伸)、72 ℃ 1 s，34個循環。采用RT-qPCR擴增儀進行SIRT3相對定量分析，SIRT3上游引物：5′-ATCGATGGGCTTGAGAGAGT-3′，下游引物：5′-AGGTTCCATGAGCTTCAACC-3′。β-actin 上游引物：5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物:5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′ 。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算 SIRT3相對表達水平。實驗組和對照組分別取3管細胞標本進行檢測，每管重復檢測3次，檢測結果取平均值。

1.3.3Western blot 檢測SIRT3蛋白表達水平 收集實驗組和對照組細胞，冰浴、搖床搖30 min充分裂解后離心，分離出待測蛋白。取30 μg待測蛋白標本經8% SDS-PAGE電泳，移至NC膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗SIRT3抗體(1∶3 000),4 ℃搖床孵育12 h，洗膜3次，每次5 min；加入辣根過氧化物酶標二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，洗膜3次，每次5 min；混合發光底物作用1 min，將NC膜覆于保鮮膜下，暗箱中顯影曝光。用相同方法檢測β-actin作為內參，實驗重復3次。

1.3.4細胞劃痕實驗檢測Huh-7細胞的遷移能力 實驗組與對照組轉染72 h后用10 μL槍頭垂直于培養板中線，比著直尺劃線，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次，加入DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，通過在顯微鏡下觀察劃痕兩側細胞的距離來比較Huh-7細胞遷移情況。

1.3.5細胞侵襲實驗檢測Huh-7細胞的侵襲能力 實驗組與對照組轉染24 h后用胰酶消化，上室(包被Matrigel碳酸酯濾膜，濾膜孔徑為8 μm)每孔分別加入含Huh-7細胞2×104個的DMEM培養基(無血清)500 μL，下室加入DMEM培養基(含10%胎牛血清)700 μL，孵育條件為5% CO2、37 ℃、10 h。輕輕擦去上室濾膜未侵襲細胞，固定后用0.1%結晶紫染色40 min，清洗后晾干，20倍倒置顯微鏡下隨機選取兩組5個不同視野統計細胞侵襲數量，取其平均值，實驗重復3次。

2 結 果

2.1兩組SIRT3 mRNA表達水平比較 與對照組相比，實驗組SIRT3 mRNA表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.001)，實驗組SIRT3質粒在Huh-7細胞中轉染成功。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.001。圖1 RT-qPCR檢測SIRT3 mRNA表達水平

2.2兩組SIRT3蛋白表達水平比較 與對照組相比，實驗組SIRT3蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot檢測SIRT3蛋白表達水平

2.3細胞劃痕實驗檢測Huh-7細胞的遷移能力 劃痕48 h時，對照組兩側邊緣的細胞已向中間明顯遷移，兩側細胞間距離明顯縮短，邊緣參差不齊，遷移痕跡較重，而實驗組兩側邊緣細胞也有緩慢遷移的跡象，但兩側細胞間的距離明顯寬于對照組，遷移距離較短。見圖3。

圖3 細胞劃痕實驗檢測Huh-7細胞的遷移能力

2.4細胞侵襲實驗檢測Huh-7細胞的侵襲能力 兩組細胞接種于上室10 h后收集，顯微鏡下計數，對照組每個視野為(45±5)個細胞，實驗組每個視野為(25±2)個細胞，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 細胞侵襲實驗檢測Huh-7細胞的侵襲能力

3 討 論

SIRT3是一種去乙酰化酶，在肝臟、心臟和褐色脂肪組織等代謝活躍的部位高表達。鑒于目前越來越多的研究將腫瘤定義為代謝性疾病，而線粒體又與代謝密切相關，SIRT3作為線粒體內主要的去乙酰化酶，猜測其必然與腫瘤代謝有著一定聯系。SIRT3可以通過調控多種細胞代謝通路影響腫瘤細胞的代謝和生長。SIRT3在一些腫瘤中發揮促進腫瘤生長的作用，如SIRT3可以保護宮頸癌細胞免受基因毒性和氧化應激介導的細胞壞死，還可以通過去乙?；疜u70，增加Ku70與Bcl-2相關X蛋白(BAX)的結合，防止BAX在線粒體易位和應激條件下引起細胞凋亡[7]；SIRT3還可使絲氨酸羥甲基轉移酶2脫乙酰化，從而促進結直腸癌的發生[8]。SIRT3在其他一些腫瘤中則發揮抑制腫瘤生長的作用，如SIRT3在骨肉瘤中通過調節活性氧和缺氧誘導因子-1α發揮抑癌基因的作用[9]；此外，其還可以通過微小RNA-708-5p抑制胰腺癌的進展[10]。本課題組在前期研究中發現，SIRT3在肝癌中表達水平明顯降低，其對肝癌細胞的增殖起抑制作用，并且可以通過糖原合成酶激酶-3β/BAX途徑誘導肝癌細胞凋亡[11]。此外，本課題組還發現，SIRT3通過調節P53途徑來誘導肝癌細胞老化[12]。

遷移和侵襲是惡性腫瘤的重要生物學特征。sirtuin蛋白家族中的一些成員也陸續被發現有影響腫瘤遷移和侵襲的能力，比如SIRT5通過調節乙酰輔酶A乙酰轉移酶1促進前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移[13]；SIRT6通過細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2-基質金屬蛋白酶9(MMP9)途徑促進骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[14]；SIRT7通過激活ERK/信號傳導與轉錄激活因子3信號通路促進神經膠質瘤細胞的增殖和侵襲[15]，其還可以通過抑制E-鈣黏蛋白促進結直腸癌細胞的增殖和侵襲[16]。SIRT3與腫瘤侵襲、遷移的關系也有較多報道，如其通過調節脂肪酸合酶促進宮頸癌細胞的侵襲和轉移[17]；通過缺氧誘導因子-1α/磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1/丙酮酸脫羥酶E1α亞蛋白抑制膽管癌的發生[18]。因此，sirtuin蛋白家族成員在不同的腫瘤組織中有不同的功能，而且同一成員在不同腫瘤中的功能也有明顯差異，說明sirtuin家族成員的功能具有細胞和腫瘤特異性。

本研究初步探討了SIRT3對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。與對照組相比，實驗組SIRT3 mRNA、蛋白的表達水平明顯升高，提示SIRT3過表達的肝癌細胞模型構建成功，進一步通過細胞劃痕實驗和細胞侵襲實驗分析過表達SIRT3對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。細胞劃痕實驗結果顯示，48 h時實驗組兩側細胞間的距離明顯寬于對照組，說明SRIT3過表達抑制了肝癌細胞的遷移能力。細胞侵襲實驗結果顯示，實驗組穿膜細胞數明顯少于對照組，表明高表達SIRT3的肝癌細胞侵襲能力受到抑制，但目前關于高表達SIRT3抑制肝癌細胞遷移、侵襲能力的具體分子機制尚不明確，這也將成為本課題組接下來的研究方向。

綜上所述，SIRT3與肝癌的發生、發展密切相關，SIRT3的高表達可以抑制肝癌細胞的遷移與侵襲，其有望為肝癌個體化治療和抗腫瘤藥物的開發提供新的方向。