不同處理對牡丹葉柄離體培養時褐化的影響

張慶瑞,趙國棟

(1.河南林業職業學院，河南 洛陽 471002；2.洛陽國家牡丹園,河南 洛陽 471011)

1 引言

牡丹(PaeoniaSuffruticosa)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)小灌木，其花型碩大、色澤艷麗、雍容華貴，自古以來，深受人們的喜愛。牡丹除了采用傳統的嫁接和分株方法進行繁殖外，近年來，組織培養技術也取得了不小的進展，但在牡丹組培過程中，外植體褐化現象嚴重，嚴重影響愈傷組織的誘導、繼代增值培養及根系的誘導[1～4]。本研究以“洛陽紅”牡丹的葉柄為外植體，通過添加不同的物質，探索防止組織培養過程中葉柄褐化的方法。

2 材料與試驗方案

2.1 材料

本實驗以“洛陽紅”牡丹的葉柄為試驗材料，進行試驗。5月份采集，修剪后經過流水清洗，75%酒精和0.1%的升汞消毒后，切成1.5 cm的小段，從中間劈開后接種。除礦物元素濃度試驗外，其余試驗方案中，基本培養基均為1/2MS培養基，添加3%蔗糖、0.75%的瓊脂。除pH值試驗外，其余培養基pH值均為5.8。培養室溫度控制在25 ℃，光照強度為1500～2000 Lux，光照時數每天10 h。

2.2 試驗方案

2.2.1 不同濃度Na2SeO3對牡丹葉柄褐化的影響

在基本培養基內分別加入不同濃度的Na2SeO3(0，0.01 mmol/L，0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，0.2 mmol/L)，研究分析Na2SeO3不同使用量對牡丹葉柄褐化的影響。每處理5瓶，每瓶接種9個葉柄。7 d后的觀察結果。

2.2.2 不同pH值對牡丹葉柄褐化的影響

將基本培養基的pH值分別調成5.2、5.8、6.6、7.4、8.0，觀察外植體葉柄的褐化情況。每處理5瓶，每瓶9個葉柄。7 d后的觀察結果。

2.2.3 蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏對牡丹葉柄褐化的影響

在基本培養基內，分別加入蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏，觀察不同生物試劑對牡丹葉柄褐化的影響。每處理5瓶，每瓶9個葉柄。7 d后的觀察結果。

2.2.4 不同礦物元素濃度對牡丹葉柄褐化的影響

以YEB為基本培養基，分別添加MS培養基中的大量元素(除Ca)，1/2MS培養基中的大量元素(除Ca)，MS培養基中的Fe、Ca鹽，一半含量MS培養基中的Fe、Ca鹽，MS培養基中的微量元素，一半含量MS培養基中的微量元素。以YEB為對照，研究不同礦物元素濃度對牡丹葉柄褐化的影響。每處理5瓶，每瓶接種9個葉。7 d后的觀察結果。

2.3 褐化程度的分級標準

將牡丹葉柄褐化程度分為6個等級，從重到輕依次為：5級，極嚴重褐化，整個外植體變為黑色；4級，嚴重褐化，整個外植體變為棕黑色；3級，中度褐化，外植體70%以上部分變色；2級，輕度褐化，外植體兩端變色較輕；1級，輕微褐化，基本上沒有褐化；0級，無褐化，沒有褐化。

褐化率=褐化數量÷接種數量×100%，

綜合褐化程度=(褐化等級×該等級的褐化數量+褐化等級×該等級的褐化數量……)÷褐化總數。

3 結果與分析

3.1 不同濃度Na2SeO3對牡丹葉柄褐化的影響

采用不同濃度Na2SeO3處理“洛陽紅”牡丹葉柄，第3d開始出現褐化，7d后統計結果(表1)。

從表1可知，Na2SeO3的防褐化效果很不理想，牡丹葉柄褐化嚴重，幾乎100%褐化，且隨著Na2SeO3使用濃度的增加，綜合褐化程度呈加重趨勢。因此，Na2SeO3顯然沒有達到控制牡丹葉柄褐化的理想效果。

表1 不同濃度Na2SeO3對牡丹葉柄褐化的影響

3.2 不同pH值對牡丹葉柄褐化的影響

不同pH值對牡丹葉柄褐化的影響結果見表2。從表2可以看出，當pH=5.2時，褐化率最低，隨著pH值的升高，褐化率升高，在pH=7.4時，褐化率達到了100%，但總體褐化程度降到最低。

表2 不同pH值對牡丹葉柄褐化的影響

3.3 蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏對牡丹葉柄褐化的影響

表3為蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏對牡丹葉柄褐化的影響結果。由表3可知，無論添加哪種生物試劑，控制褐化的效果都不理想，不僅出現了100%褐化，褐化程度亦非常嚴重，所以這三種生物試劑對抑制牡丹葉柄褐化作用不明顯。

表3 生物試劑對牡丹葉柄褐化的影響

3.4 不同礦質元素對牡丹葉柄褐化的影響

由表4可以看出，無論添加MS培養基中的哪種成分，與對照相比，各處理的褐化均顯著加重，褐化率也較高。添加1/2MS大量元素(無鈣)、MS大量元素(無鈣)、1/2的MS Ca鹽Fe鹽、MS的Ca鹽Fe鹽等組合褐化率均達到100%，褐化程度方面，添加Ca鹽Fe鹽的組合均顯著高于添加大量元素的組合。添加MS微量元素(無鐵)組合的荷花率為90.7%，褐化程度顯著低于添加添加Ca鹽Fe鹽組合和添加大量元素的組合，顯著高于添加1/2的MS微量元素(無鐵)。

表4 不同礦質元素濃度對牡丹葉柄褐化的影響

4 結論與討論

某些植物材料在組織培養過程中會產生水解型多酚，這類外植體在培養過程中其培養基的顏色會變深，原因是多酚類物質分泌到培養基中，之后被氧化為醌類物質，而這些多酚類物質和醌類物質會抑制多種酶的活性，使得外植體對營養物質的主動吸收和轉化受到阻礙[5]。本實驗預通過添加Na2SeO3、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏等影響酚類化合物與酶結合，從而避免醌類物質的出現，阻止褐化的產生。但試驗結果表明：該4種藥品并沒有起到有效的控制褐化的效果，對該研究沒有實際意義。

成功的經驗表明，選擇適當的外植體并建立最佳的培養條件是克服材料褐化的最主要手段[6]。在牡丹葉柄組織培養的防褐化研究中，綜合考慮褐化率及總體褐化程度，在牡丹葉柄組培中，應選用pH=5.2的培養基。一般認為，無機鹽成分為組織培養眾多的因子中較為重要的因素[7]?；趯Σ煌V質元素濃度對牡丹葉柄褐化影響的研究，在確保礦質營養元素充足的情況下，降低礦質營養元素含量有利于控制褐化。