利用高通量表型平臺分析紫葉紫菜薹新組合19-520的表型特征

朱紅芳 李曉鋒 奚丹丹 高璐 張兆輝 朱玉英

摘要：?以紫葉紫菜薹組合19-520和2個親本材料為試驗材料，于播種后75 d，以普通綠葉紫菜薹為對照，采用高通量表型平臺進行表型測定和LemnaTec Scanalyzer 3D成像。研究了紫葉紫菜薹組合19-520及其親本株高、幅寬、緊密度、投影面積和植株相對含水量等指標的差異。結果表明，紫葉紫菜薹組合19-520的株高、幅寬、植株緊密度、投影面積、相對含水量和花青素相對含量均較高，表型特征表現優良。因此，紫葉紫菜薹組合19-520作為新的紫菜薹組合在綜合表型上表現良好，可進一步推廣應用。

關鍵詞：?紫菜薹;株高; 投影面積;緊密度;相對含水量

中圖分類號：?S634.6??文獻標識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0465-06

Abstract：?The combination of 19-520 and its two parent materials were used as the test meterials and the normal green leaf purple-caitai was used as the control to test the phenotype and make the LemnaTec Scanalyzer 3D imaging by using the high-throughput phenotype platform 75 days after sowing. The differences in plant height， width， compactness， projection area and relative water content of the combination 19-520 and its parents were studied. The results showed that the plant height， width， plant compactness， projection area， relative contents of water and anthocyanin of 19-520 were all better than its parents and the normal green leaf purple-caitai， and the phenotypic characteristics were excellent. As a new purple leaf purple-caitai combination，19-520 has significant comprehensive phenotypic characteristics， which can be further applied in popularization and application.

Key words：?purple-caitai;plant height;projection area;compactness;relative water content

植物遺傳學、育種學和生物信息學的研究離不開植物基因型、表型和環境這3個因素[1]，生物學家Freimer等[2]、Houle等[3]和Gjuvsland等[4]先后對表型進行了定義，認為表型是生物某一特定的物理外觀或者結構組成，也就是植株個體在特定環境條件下表現出來的性狀特征總和。研究生物表型特征的學科被稱為表型組學，這一概念由Steven A.Garan在1996年最早提出，他將生物各方面的表型特征作為一個整體來研究，這個研究的整體即為表型組學。將生物群體詳細的表型數據信息結合生物群體的基因型特征進行分析，是基因組學研究的基礎，并可以應用于復雜生物體生命系統的研究中[5]。利用可見光、超光譜、近紅外、遠紅外以及X光成像技術構建分析平臺，并利用該平臺進行表型分析的組學稱為高通量表型組學，利用高通量表型組學可以在短時間內實現大量植物個體多維表現型的高精度獲取和定量分析現代技術體系[6]。

近年來，高通量表型技術得到快速發展[6]，各類表型測量儀器和表型平臺迅速被開發和建立[7]，進一步提升了全自動、高通量表型成像技術，能更加準確、快速、標準地進行表型研究[8]，與傳統的植物表型性狀的調查分析相比，高通量表型技術測量分析更省時省力，受人為因素影響很小，不需要破壞組織進行取樣，且能連續監測植物的生長狀態和植物的動態變化[9-10]。在水稻[11]、玉米[12]和谷類[13]等作物上逐漸被應用。高通量表型技術的發展為系統地研究植株表型以及加快植物新品種的選育提供了技術支撐。

AgriPhenoTM開放式科研平臺由上海澤泉科技股份有限公司在浦東孫橋現代農業園區投資建設，該平臺是國內第一家為植物研究和育種提供高通量植物表型分析、植物基因型分析以及植物表型-基因型聯合分析服務的平臺。引進了目前全球先進的與表型植物育種相關的設施和設備，為植物生長、生理生態變化、基因型和表型結合分析提供全面服務[14]。

紫菜薹（Brassica compestris L. var. purpurea Bailey 2n=2x=20）原產于中國，主栽于湖北、湖南和重慶等長江流域地區，又名紅菜薹，是十字花科蕓薹屬亞種之一。紫菜薹的薹色紫紅而鮮亮，薹葉較小，主要食用器官為花薹和薹葉，新鮮的花薹和薹葉看上去肥嫩多汁，嘗起來脆爽可口，且富含多種礦質元素。近幾年，紫菜薹因其紫色的花薹富含豐富的營養物質尤其是具有保健功能的花青素，已經作為優質高檔的蔬菜在全國范圍內引種栽培[15-16]。花青素分為天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛花色素和錦葵色素等6大類，它不僅使蔬菜、水果和花卉看起來五彩繽紛，而且具有抗氧化能力，對心臟病、動脈硬化、靜脈炎、關節炎、過敏、老年性癡呆、冠心病及癌癥等有防治作用。隨著人們生活水平的提高，花青素的保健作用逐步引起人們的重視，對紫菜薹新品種的要求也越來越高，為此本課題組經過多年的育種工作，創制了葉片、葉柄和菜薹均富含花青素的新種質，并選育出具有發展潛力的紫葉紫菜薹新組合19-520。

本試驗借助上海澤泉科技股份有限公司的AgriPhenoTM開放式科研平臺對已育成的紫葉紫菜薹新組合19-520進行表型數據收集，分析該組合在生長中的表型特征。為紫葉紫菜薹的推廣和應用，提供更多表型數據和理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗地概況

該試驗于2019年12月至2020年1月在上海澤泉科技股份有限公司的玻璃溫室內進行，該公司位于上海自由貿易試驗區，屬北亞熱帶季風氣候。

1.2?試驗材料

供試紫菜薹是由上海市農業科學院園藝研究所經過多年的培育獲得的紫葉紫菜薹新組合19-520及19-520的親本P1、P2。該組合屬于晚熟類型，葉片、葉柄、葉脈以及花薹均為紫色，花薹略帶蠟粉;親本P1屬于中晚熟類型，葉片、葉柄、葉脈以及花薹也均為紫色，花薹無蠟粉;親本P2屬于晚熟類型，葉片、葉柄、葉脈以及花薹也均為紫色，花薹略有蠟粉。對照（CK）為普通綠葉紫菜薹，葉柄、主葉脈和花薹均為紫色，花薹略帶蠟粉。

1.3?試驗處理

2019年8月10日選取飽滿、整齊一致的種子，點播在穴盤中，基質為泥炭和蛭石的混合物，體積比為3∶1。播種后30 d進行大棚定植，45 d后每個材料選擇3株大小一致的植株，進行表型成像，每株選取第三片功能葉，分別進行各項指標的測定。花薹長到35 cm左右時取CK、新組合19-520以及新組合19-520的親本P1和P2的葉片、葉柄和花薹測定花青素的含量，每個品種（組合）選擇9株，每3株混合取樣，作為1個重復，共3次重復，測定方法參照試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司產品）說明書，應用雙抗體夾心法測定樣品中花青素（ANTH）水平。

1.4?測定項目與方法

1.4.1?圖像獲取?先選擇高通量表型平臺上的可見光成像系統進行成像，然后利用德國LemnaTec公司的Scanalyzer3D成像軟件Lemna Control進行圖片獲取，拍照時可以選擇可見光與近紅外雙鏡頭對放入平臺的供試材料進行拍照，并對供試材料進行無損成像。可見光鏡頭和近紅外鏡頭的成像角度均選擇頂部、側面0°和90°。可見光鏡頭參數設置為，頂部exposure 20、focus 2 000、zoom 2 000，側面exposure 20、focus 3 500、zoom 1 500;近紅外鏡頭參數設置為，頂部exposure 30 030、focus 500、zoom 1 500，側面exposure 30 030、focus 100、zoom 1 500。成像后選擇單株頂部、側面0°和側面90°的原始圖像各1張，并保存至系統的Lemna Base文件中[14]。

1.4.2?數據分析?數據分析根據何紅梅等[9]報道的步驟進行，首先，Lemna Mine導出原始數據（以pixel為單位）。然后，利用像素轉換系數（pix-el/mm）將原始數據轉換為以國家標準為單位的數據在Excel 2010軟件上整理。最后，利用LemnaTec Scanalyzer 3D的分析軟件Lemna Grid編輯圖像，并計算紫菜薹植株生長相關的表型數據。表型數據的計算分析主要包括株高、幅寬、總投影面積、緊密度和植株相對含水量。其中株高和幅寬采用側面 0°與側面 90°數據的平均值，總投影面積為側面0°、90°與頂部數據的總和。所獲得的樣本數據都用Excel進行整理，并計算平均值和標準差。利用SPSS 20軟件對數據進行方差分析和差異顯著性檢驗。

2?結果與分析

2.1?紫菜薹表型及分析圖的獲得

紫菜薹在高通量表型平臺上，通過可見光和近紅外進行表型成像后，每一個單株都獲得3張RGB圖像，分別為紫菜薹植株頂部圖像、側面0°和側面90°圖像，如圖1所示，a為植株頂部的成像，b1 和b2分別為側面0°和側面90°成像，并列出親本P1和P2，紫葉紫菜薹組合19-520及CK的相關表型圖像及其分析圖。根據可見光和遠紅光成像的圖片分析可以獲得植株的株高、幅寬、緊密度、相對含水量等重要的農藝表型特征。

2.2?紫菜薹的株高與幅寬

植株的株高和幅寬是衡量植株高矮和水平寬窄的重要指標，紫菜薹植株的株高和幅寬是利用可見光側面成像得到的。植株株高計算的是植株根基部到頂部之間的距離，幅寬計算的是植株水平寬度。由圖2可知，紫葉紫菜薹組合19-520的植株幅寬為662.54 mm，與CK差異不顯著，與雙親P1和P2差異顯著。紫葉紫菜薹組合19-520的植株株高為736.57 mm，與CK及其雙親P1和P2差異顯著。說明紫葉紫菜薹組合19-520植株高，水平幅寬寬，在生長勢上比其親本具有一定的雜交優勢。

2.3?紫菜薹的緊密度

緊密度是衡量植株緊密程度的指標，本試驗的緊密度根據頂部獲得的表型數據，按照植株的投影面積與最小外接多邊形面積的比值分析，比值越大，植株越緊密。由圖3可見，紫葉紫菜薹組合19-520的頂部緊密度為0.50，比CK及其親本P1和P2顯著增加。紫葉紫菜薹組合19-520在其親本和CK中的頂部緊密度表現為最高，說明紫葉紫菜薹組合19-520植株在生長過程中葉片、葉柄最為緊密。

2.4?紫菜薹的投影面積分析

光投射在物體上所留下影子的面積為投影面積，受投影不同角度的影響而產生不同的投影面積，其中總投影面積為紫菜薹植株頂部、側面0°、側面90°的投影面積之和[17]。如圖4所示，紫葉紫菜薹組合19-520的總投影面積最大，顯著高于CK、P1和P2的總投影面積。

2.5?紫菜薹的相對含水量分析

植株相對含水量主要是通過近紅外成像獲得[18]，在近紅外分析圖中，相對含水量根據成像圖片中植物深淺分級，顏色越深，相對含水量越高，灰度分級也就越低[9]。本試驗中以頂部和側面0°的成像進行植株相對含水量分析。頂部近紅外成像共分為10級，灰度值介于80～200。從圖5可知，4份材料的相對含水量均主要集中在2～5級，其余的等級所占百分比較少。組合19-520及其親本的2級相對含水量所占百分比均低于CK。4份材料中3級相對含水量所占百分比均最高，其中組合19-520的3級相對含水量所占百分比最大，為58.89%，其次是CK和P1，分別為57.67%和57.13%，P2最小，為33.05%。除親本P2以外，其他3份材料植株頂部2～5級相對含水量占比均為90%左右。

側面0°近紅外成像分析的灰度值也共分為10級，介于60～200，由圖5的側面成像可知，4份材料的相對含水量主要集中在1～5級，組合19-520的1級相對含水量所占百分比為2.76%，其親本P1、P2及CK基本沒有1級。 2級相對含水量所占百分比最高是組合19-520，為19.19%，其次分別為P2、CK、P1。3級相對含水量是4份材料中相對含水量占比均為最高的，從高到低依次為親本P2（58.28%）、組合19-520（39.40%）、CK（37.72%）、親本P1（20.37%）。除親本P1以外，其他3份材料植株頂部的2～5級相對含水量占比均大于90%。

2.6?紫菜薹的花青素含量

由表1可見，紫菜薹花青素相對含量在葉片、葉柄和花薹中存在著較大的差異。紫葉紫菜薹組合19-520的葉片和葉柄的花青素相對含量介于2個親本之間，葉片的花青素相對含量比CK高96.53%，葉柄的相對含量則比CK高36.31%。而花薹的花青素相對含量則不僅高于2個親本，而且高于CK，差異顯著。

3?討論

隨著市場需求的增大，紫菜薹種植面積逐漸增加，相關研究也越來越受到關注，目前對紫菜薹的研究主要集中在紫色性狀和分蘗性狀方面[19]，有關表型的研究很少。本試驗利用AgriPhenoTM表型平臺溫室Scanalyzer3D儀器，以普通綠葉紫菜薹為對照，對紫葉紫菜薹新組合及其雙親進行表型分析。從其葉片、葉柄和花薹的顏色和測定的花青素相對含量等指標可知，紫葉紫菜薹組合19-520葉片，葉柄和花薹花青素含量均較高。本試驗結果表明，特色紫葉菜薹組合19-520在幅寬、株高和緊密度上較親本及普通綠葉紫菜薹好，為紫菜薹的表型育種提供了數據支撐。

本試驗中紫葉紫菜薹組合19-520總投影面積均高于其雙親和對照，表明了其在生物量和葉面積上比其雙親和對照高，這與Hairmansis等[11]的結論一致，認為不同角度的投影面積可以簡單地評估植株的生物量或葉面積的大小。

植株的相對含水量是衡量植株品質的一個指標，其含水量越高，干物質含量就相對減少，則會影響產品品質[9]。本試驗結果表明，紫葉紫菜薹組合19-520及其親本和對照主要以2～5級的相對含水量為主，均占到整個植株相對含水量的90%左右，其干物質含量占比相差不多，品質差異不大。通過使用溫室型Scanalyzer3D儀器，獲得了大量的表型數據，我們在眾多的表型數據中，選擇株高、幅寬、緊密度、投影面積和植株相對含水量等幾個主要農藝性狀指標，對紫葉紫菜薹組合19-520及其雙親和普通綠葉紫菜薹進行表型差異分析，結果表明，高通量表型儀器及其分析軟件能快速獲取植株的表型數據，并根據育種的需要篩選具有代表性的農藝性狀指標進行分析，迅速掌握植株在生長過程中的表型性狀，為培育優良新品種以及新品種的表型鑒定和品比試驗提供高通量的數據，有助于新品種的選育。表型數據和基因組數據的結合、比對和分析，將大大提高人們對植物數量性狀的選擇能力，從而促進高通量表型育種的發展。但如何利用表型分析獲得的相關參數，以及如何將表型數據與產量和品質更好地進行相關性分析，還需要進一步的研究。后期的工作將對紫葉紫菜薹的產量和品質與其投影面積、葉面積等高通量的表型數據的相關性進行進一步的分析和研究。

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（責任編輯：陳海霞）